A102/B301亚型血型特点分析

A102/B301亚型血型特点分析

胡彬，潘海平，朱于莉，冯智慧

(青岛市中心血站输血研究所，山东青岛266071)

摘要：目的报告1例A102/B301亚型血型，分析其血型特点。方法对1例无偿献血者的全血标本用血型血清学方法鉴定血型，对ABO基因第6、7外显子核苷酸序列采用直接测序和克隆测序进一步鉴定亚型。结果该样本血清学结果显示为AB亚型。测序结果与标准序列A101对比显示，该样本第6、7外显子297A/G、467C/T、526C/G、657C/T、703A/G、796A/C、803C/G、930A/G、1054C/T、1096A/G杂合，进一步针对第6、7外显子克隆测序结果显示该样本为杂合序列，分别与标准序列A101对比显示其中一条467为T，另外一条序列与B101序列比对发现，第1 054位碱基C>T导致第352位氨基酸由精氨酸变为色氨酸，确定为A102/B301亚型。结论 发现1例罕见的A102/B301亚型；对于正反定型不符的血清学表现血型，应进一步采用基因检测以确定其血型亚型。

关键词：ABO血型系统；AB亚型；基因型；测序

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.041

中图分类号：R457.1 文献标志码：B

基金项目：山东省青岛市市南区科技发展资金项目(2013-13-013-YY)。

收稿日期：(2015-05-20)

通信作者：冯智慧

ABO血型系统是最重要的血型系统。除标准的A、B、O和AB表型外，还可出现A1和A2亚型及其他罕见亚型。单碱基突变是大多数亚型产生的原因[1]。Salmon参照A变异型分类方法，将B亚型分为B3、Bx、Bm、Bel，不符合这4种类型的其他B亚型均归为Bw[2]。目前,B3被认为是最稀少的一种B亚型，中国人群中大约900个B型个体中有1例是B3，1 800例A1B献血者中有1例是A1B3[3]。2014年11月，我们鉴定出1例呈A102/B301亚型的无偿献血者血型，现报告如下。

1材料与方法

1.1材料1例健康男性无偿献血者的EDTA-Na2抗凝全血标本，献血者年龄26岁，无输血史及重大疾病史。

1.2试剂及仪器试剂：单克隆抗A、抗B、多克隆抗人球蛋白试剂、ABO细胞、抗体筛选细胞均为Sanquin公司试剂；抗H、抗A1、抗AB购自上海生物制品有限公司；人源抗A、抗B购自成都血研所；基因组DNA提取试剂盒购自Invirtrogen公司；Exon6、7测序引物(PAGE级)、Ex-Taq试剂盒、LA-Taq试剂盒和及高效克隆PCR产物专用载体(pMD18-T vector)由TaKaRa公司提供。仪器：Kubo7A 2420细胞洗涤离心机；Bio-Rad C1000 PCR扩增仪；美国AB公司3100-Avant型测序仪。

1.3血型血清学检测EDTA-Na2抗凝外周静脉血，采用试管法进行ABO正反定型，用筛选细胞对样本血清进行抗体筛选，以明确或排除不规则抗体的存在。

1.4血型序列分析盐析法提取血液标本全基因组DNA，操作步骤参照试剂盒说明书。对ABO基因第6和第7外显子进行序列分析，引物设计参照Olsson[4]设计的两对引物对Exon6和Exon7进行扩增，测序引物分别为：Exon Ⅵ正义链为5′-CGGAATTCACTCGCCACTGCCTGGGTCTC-3′，反义链为5′-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA-3′；Exon Ⅶ正义链为5′-CGGGATCCCCGTCCGCCTGCCTTGCAG-3′，反义链为5′-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3′。将第6、7外显子测序结果与标准序列A101对比。PCR扩增反应程序如下：95 ℃预变性10 min，94 ℃ 60 s、63 ℃ 90 s、72 ℃ 60 s共10个循环，94 ℃ 60 s、61 ℃ 90 s、72 ℃ 60 s共25个循环，72 ℃延伸10 min，10 ℃保温。扩增产物切胶纯化，正反双向测序。使用LA-Taq酶特异性扩增ABO基因Exon6、Intron6和Exon7行单倍体序列分析，将PCR产物克隆入T载体，挑取多个阳性菌落进行测序鉴定，确定样本的单倍型。

2结果

2.1血型血清学结果见表1。

2.2血型序列分析 ABO第6、7外显子测序297A/G、467C/T、526C/G、657C/T、703A/G、796A/C、803C/G、930A/G、1054C/T、1096A/G杂合。ABO第6、7 外显子单倍型测序示，其中一条单倍型为A102，另外一条单倍型序列与B101比对发现，在第1 054位碱基发生了C>T的突变，导致352位氨基酸由天冬氨酸转变为色氨酸，确定基因型为A102/B301亚型。

表1　1例A 102/B 301亚型的血清学正反定型结果

注：抗-H与Bc反应2+，与Oc反应4+。

3讨论

ABO血型系统是临床输血及移植相关的最重要的血型系统。除了常见的A1和A2亚型外，还存在其他罕见的ABO亚型，其他罕见的亚型通过A和B抗原的量以及在红细胞上的分布进行分类[5]。基因改变是亚型发生的基础，ABO基因碱基突变可致表达糖基转移酶的氨基酸改变[6,7]，可能会导致抗原合成减少，从而在血清学实验中表现为抗原与抗A或抗B的反应强度减弱[9,10]。研究表明，同一位置不同种类和性质的氨基酸置换可导致血清学表型的巨大差异，氨基酸极性发生改变，造成蛋白质构象改变，进而影响酶蛋白的催化活性和抗原表达，影响酶蛋白的三维结构[11,12]。进而导致ABO血型基因的产物A和(或)B血型糖基转移酶活性改变，造成血清学改变，导致正反定型不符、凝集强度与凝集状态改变或检出不规则抗A或抗B[13]。

红细胞血型血清学技术虽然相对较完善和标准化，但其只能鉴定表型，在对亚型、因疾病导致的血型改变、部分疑难标本的ABO分型和做遗传学分析时受到局限[14]。基因分型技术可克服血型血清学方法的局限性，是鉴定ABO血型分析的重要手段[15]。本研究发现，采用血清学检测后，该样本血清学正反定型不符，正定B抗原减弱，反定检出抗B抗体，依据血清学定为AB亚型；ABO第6、7外显子测序结果显示第1 054位碱基为C/T杂合，进一步克隆测序结果显示其中一条序列为A102，另一条序列与B101比较，第1 054位碱基发生C>T的改变，该样本的序列分析结果符合A102/B301亚型，考虑该碱基的改变导致第352位氨基酸由天冬氨酸变为色氨酸。大多数B3亚型血清学表现3+混合视野凝集现象，而本组该样本用试管法多次离心后，混合视野凝集强度仅显示弱阳性，推测原因,为该样本的A抗原竞争性占据了红细胞上的抗原表位,导致B抗原表达进一步减少。此外，我们在采用临床经常使用的凝胶卡进行正反定型的过程中，发现正定型抗B结果显示阴性，提示该样本在临床非常容易被错定为A型,从而发生输血错误。

参考文献：

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