坤泰胶囊对促排卵小鼠子宫内膜溶血磷脂酸受体3、环氧合酶2表达的影响

·基础研究·

坤泰胶囊对促排卵小鼠子宫内膜溶血磷脂酸受体3、环氧合酶2表达的影响

王慧，李玉洁，南燕，陈帆

(新乡医学院第三附属医院，河南新乡453003)

摘要：目的观察坤泰胶囊对促排卵小鼠子宫内膜溶血磷脂酸受体3(LPAR3)、环氧合酶2(COX-2)表达的影响，探讨其是否具有提高子宫内膜容受性的作用。方法将90只6～8周龄的昆明雌鼠随机分为三组，各30只。A组：每天生理盐水灌胃1次(连续1个月)，控制性超促排卵(COH)；B组：每天坤泰胶囊生理盐水溶解后灌胃1次(连续1个月)，COH；C组：每天生理盐水灌胃1次(连续1个月)。雌鼠与雄鼠以2∶1合笼，检查雌鼠次日晨阴栓(按天数表示为d1～d6)。每天每组处死5只雌鼠，取其子宫，观察子宫内膜腺体发育情况，检测其LPAR3、COX-2。结果d4，A、B、C组子宫内膜腺体数分别为(13±3)、(20±2)、C(17±2)个，B组与A、C组相比，P均<0.05。d3,A、B、C组子宫内膜LPAR3的积分光密度值(IOD值)分别为0.293±0.019、0.255±0.014、0.253±0.032，B组与A组相比，P<0.05；d4，A、B、C组子宫内膜LPAR3的IOD值分别为0.207±0.022、0.330±0.026、0.311±0.019，B组与A组相比，P<0.05。d4、d5、d6，A组子宫内膜COX-2的IOD值分别为0.282±0.019、0.419±0.052、0.573±0.057,B组分别为0.176±0.018、0.288±0.020、0.417±0.053,两组相比，P均<0.05。结论坤泰胶囊可调控COH小鼠子宫内膜LPAR3及COX-2的表达，发挥提高子宫内膜容受性的作用。

关键词：坤泰胶囊；控制性超排卵；子宫内膜容受性；溶血磷脂酸受体3；环氧合酶2；动物实验

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.008

中图分类号：R714 文献标志码：A

基金项目：河南省高等学校骨干教师科研基金资助项目(2012GGJS-135)。

收稿日期：(2015-07-16)

通信作者：李玉洁

在辅助生殖技术的实施过程中，控制性超促排卵(COH)技术的应用，使得获取高质量的卵子成为可能，但是胚胎的临床妊娠率却一直徘徊在30%～40%[1]。子宫内膜容受性因此而成为研究的热点。坤泰胶囊由熟地黄、黄连、白芍、阿胶、黄芩、茯苓等中药组成，对更年期大鼠具有增加子宫湿重及子宫营养的作用[2]。2014年5月25日～8月25日，我们观察了坤泰胶囊对促排卵小鼠子宫内膜溶血磷脂酸受体3(LPAR3)、环氧合酶2(COX-2)表达的影响，探讨其是否具有提高子宫内膜容受性的作用。

1材料与方法

1.1实验动物及分组清洁级6～8周龄昆明雌鼠90只，8～10周龄昆明雄鼠45只，雌雄分笼饲养，自由取食水，室温22～25 ℃。将雌鼠随机分为A、B、C组，各30只，三组雌鼠体质量有可比性。

1.2方法

1.2.1坤泰胶囊给予方法及COH方法B组：将坤泰胶囊生理盐水溶解后(浓度为50 mg/mL)灌胃1个月，每只每天0.7 mL(根据许文生公式和Meeh-Rubner公式计算确定)。A、C组：生理盐水灌胃1个月,每只每天0.7 mL。各组于灌胃第2天开始，采用阴道涂片法观察雌鼠动情周期(分为动情前期、动情期、动情后期、动情间期)。三组灌胃20 d后，即小鼠发情后期，A、B两组于上午9时腹腔注射促性腺激素释放激素拮抗剂(GnRHa)1.5 μg/100 g，连续9 d，第9天加注孕马血清(PMSG)10 IU/只，48 h后腹腔注射HCG 10 IU/只;C同组时注射同等剂量生理盐水。HCG注射日当晚，按雌鼠∶雄鼠=2∶1的比例将A、B、C三组雌鼠与雄鼠合笼，次日晨7～8时检查三组雌鼠的阴栓，连续6 d(按天数表示为d1～d6)。

1.2.2标本的获取、子宫内膜腺体计数及LPAR3和COX-2的检测d1～d6，A、B、C三组每天每组处死5只雌鼠，取其子宫组织，4%多聚甲醛固定、切片。部分子宫组织切片HE染色后，×400显微镜下随机选取5个视野，计数5个视野腺体数之和，以此作为一个样本量(各组仅统计d4的子宫内膜腺体数)。部分子宫组织切片免疫组化染色，采用Image-Plus6.0软件进行光密度矫正后测量LPAR3、COX-2的IOD值,随机选取5个高倍镜视野的积分光密度值(IOD值)，取5个视野IOD值的平均值作为一个样本量。

1.2.3统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1d4的A、B、C组子宫内膜腺体数比较d4，A、B、C组子宫内膜腺体数分别为(13±3)、(20±2)、(17±2)个；B组与A、C组相比，P均<0.05；B组与C组相比，P>0.05。

2.2A、B、C组子宫内膜LPAR3表达比较A、B、C组子宫内膜LPAR3的IOD值比较见表1。

表1　A、B、C组LPAR3的IOD值比较

注：与A组同一时间点相比，*P<0.05。

2.3A、B、C组子宫内膜COX-2表达比较A、B、C组子宫内膜COX-2的IOD值比较见表2。

表2　 A、B、C组COX-2的IOD值比较

注：-表示未检测到；与A组同一时间点相比，*P<0.05。

3讨论

本研究结果显示，A组子宫内膜腺体少,推测COH可能在一定程度上影响子宫内膜容受性而导致临床妊娠率低[2,3]。因此，在辅助生殖技术的实施过程中，解决COH导致的种植窗期子宫内膜容受性低下的问题，是解决胚胎种植率低的切入点。

溶血磷脂酸(LPA)存在于机体的血清、房水、精浆等多种体液中，其受体有四种，分别为LPAR1～4。LPAR3基因缺陷的雌性小鼠子宫内膜COX-2、前列腺素(PGS)表达降低，并出现胚胎种植的延迟[4]。COX-2是合成PGS的限速酶。郭燕红等[5]推测LPAR3可能通过LPAR3/COX-2/PGS下游信号来调节胚胎着床，COX-2基因突变的雌鼠可以表现出多种生殖功能异常。本研究结果显示，LPAR3表达于雌鼠子宫内膜上皮及腺上皮细胞胞质，且在子宫内膜上的表达具有规律性，均有峰值出现，A组峰值出现在d3，B、C组出现d4，B组峰值高于A组;COX-2主要分布于雌鼠子宫内膜上皮、腺上皮、基质细胞及血管内皮细胞的胞质中，且在LPAR3峰值出现时开始表达，A组的COX-2较B、C两组出现早。

小鼠子宫内膜的种植窗为雌雄合笼后第4日至第5日晨，约18 h[6]。胞饮突为目前公认的子宫内膜容受性评价指标之一，雌雄鼠在合笼第4天出现完全发育的胞饮突[5]。本研究的B组与C组LPAR3峰值均出现在d4，COX-2于d4开始出现，与胞饮突出现时间一致，且B组LPAR3峰值高于A组峰值。可见坤泰胶囊在改善子宫内膜发育不良的同时，也改善了COH引起的LPAR3、COX-2表达异常。A组LPAR3峰值提前出现且较B组低，COX-2出现较早，d4腺体发育不良；B组d4天腺体较多、LPAR3表达较高。研究[7]发现，COX-2诱导产生的PGS是胚胎着床、子宫内膜蜕膜化过程中增加内膜血管通透性及胎盘血管形成至关重要的因子。坤泰胶囊可能主要是改善COH小鼠子宫内膜上LPAR3的时空表达，从而间接改善COX-2的适时表达，起到改善小鼠子宫内膜发育、提高子宫内膜容受性的作用。

参考文献：

[1] 魏丽坤,张雷,王蔼明,等.子宫内膜容受性的评价及其改善措施[J].生殖与避孕，2008,28(5)：298-303.

[2] 张绍芬，朱慧庭，刘旸,等.坤泰胶囊对更年期大鼠卵巢功能及子宫内膜影响的实验研究[J].中华老年杂志，2004,23(9)：648-651.

[3] 付连方.控制性超排卵(COH)药物GnRHɑ对小鼠子宫内膜整合素ɑv、B1表达的影响[J].医学检验与临床，2006,17(6)：33- 34.

[4] Ye X,Hama K,Contos JJ,et al.LPA3-mediated lysophosphatidic acid signaling in embryo implantation and spacing[J] .Nature ,2005,435(7038):104-108.

[5] 郭燕红，张雷，邵素霞，等.溶血磷脂酸受体3在小鼠胚胎围着床期子宫内膜的表达及意义[J].解剖学报，2009,40(1)：141-145.

[6] Wang H, Das SK. Roadmap to embryo implantation:clues from mouse models[J]. Nat Rev Genet， 2006，7(3):185-199.

[7] Chakraborty I, Das SK,Wang J, et al. Development expression of the cyclooxygebase-1 and cyclooxygebase-2 genes in the peri-implantation mouse uters and their differential regulation by the blastocyst and ovarian steroids[J]. J Mol Endocrinol, 1996,16(2):107-122.