MicroRNA-150基因敲除小鼠鉴定

MicroRNA-150基因敲除小鼠鉴定

曹倩文宋天姣王娜田雨郑全辉①

(华北理工大学预防医学院；①基础医学唐山市慢性病临床基础研究重点实验室河北唐山063000)

[摘要]①目的通过基因组特异PCR扩增鉴定MicroRNA-150基因敲除小鼠。②方法利用碱裂解法提取鼠尾基因组DNA，在小鼠MicroRNA-150基因两端设计特异引物，PCR扩增检测。③结果正常对照小鼠DNA经PCR扩增产生长度为866个碱基对的DNA片段，MicroRNA-150基因敲除小鼠产生长度为262个碱基对的DNA片段。④结论通过碱裂解法提取鼠尾DNA并采用特异引物扩增能够准确鉴定MicroRNA-150基因敲除小鼠。

[关键词]MicroRNA-150基因敲除基因鉴定

[中图分类号]Q 784[文献标识码]A

【基金项目】华北理工大学大学生创新创业训练计划项目(编号：X2015153)；国家自然科学

【通讯作者】郑全辉。

Genomic identification of microRNA-150 knockout miceCAOQianwen,SONGTianjiao,WANGNa,etal(CollegeofPublicHealth,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology，Tangshan063000,China)

ABSTRACT[]ObjectiveTo identify microRNA-150 knockout mice(miR-150KO )by genomic PCR amplification.MethodsMouse tail DNA was extracted by alkaline lysis,and amplified by PCR using primers that designed at each end of the miR-150 gene.ResultsWild type ( WT) mice produced a 866 base pair DNA fragment,while miR-150KO mice produced a 262 base pair DNA fragment after mouse tail DNA PCR amplification.ConclusionMiR-150KO mice can be accurately identified by PCR amplification,which using alkaline lysis extracted genomic DNA and miR-150 gene specific primers.

[KEYWORDS]MicroRNA-150.Gene knockout.Genomic identification

MicroRNA-150(miR-150)是一个长度为22个核苷酸的微小RNA，在骨髓、脾脏、淋巴结等免疫器官中显著表达，其异常表达会导致多种与免疫系统和造血系统相关的疾病发生[1]。笔者从美国Jackson 实验室引入miR-150基因敲除(miR-150 knock out,miR-150KO)和野生型对照(WT)C57 BL/6小鼠，研究miR-150对免疫系统发育和功能的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂。NaOH、Tris等生化试剂购自北京经日今典科技有限公司，Taq DNA Polymerase,10×Taq Buffer,dNTP，25mM MgCL2等购自Thermo Fisher Scientific 公司；DNA Marker 2000购自北京百泰克生物技术有限公司；琼脂糖购自Gene Company Limited；GoldviewⅠ型核酸染色剂购自北京索莱宝科技有限公司。引物为上海生工公司合成。

1.1.2小鼠。C57BL/6背景的miR-150KO小鼠和野生型对照(WT)C57BL/6小鼠购自美国Jackson实验室，并在华北理工大学SPF级实验室小鼠房繁育。

1.2实验方法

1.2.1鼠尾DNA提取。剪鼠尾2～3mm至EP管，加入75μL DNA提取液/管(25mM NaOH/0.2mM EDTA)；将加有DNA提取液的EP管上置于“漂”上，98℃孵育1h，充分裂解鼠尾。待水浴后的EP管降至室温后，加入中和试剂75μL/管(40mM Tris HCL，pH=5.5)；用离心机离心3min，4000转/min,留取上清备用。

1.2.2PCR扩增。实验所采取的引物：上游：5-CAAGGACAGGAACCCTTCAGCA-3；下游：5-CCATGATGCCTGGAAGACATTTC-3；PCR反应体系(总共20μL):10×Taq Buffer 2μL，dNTP Mix 2μL，Forward Primer 1μL，Reserve Primer 1μL，25mM MgCL22μL，Template DNA 5μL，Taq DNA Polymerase0.5μL，Water6.5μL。反应条件：预变性94℃ 3min；变性94℃ 30s；退火60℃ 1min；延伸72℃ 1min；共40个循环，最后再延伸72℃ 3min；最终4℃保存。

1.2.3琼脂糖凝胶电泳。用0.4g琼脂糖，0.5×TBE和2μL GoldviewⅠ型核酸染色剂配2%琼脂糖凝胶，电泳液为0.5×TBE。将10μL PCR扩增产物加于加样孔中，在凝胶的最左或最右加样孔中加入10μL DNA Marker。电泳电压107V，30min。

2结果

2.1鼠尾 DNA提取取WT和miR-150KO鼠尾裂解液上清10μL进行琼脂糖凝胶电泳，检测组织DNA释放和变性情况。图1结果表明，鼠尾组织经强碱变性及加热处理1h后，产生大量长度在250个碱基对(bp)以上的DNA片段。见图1。

注：M:DNA maker,1:WT鼠尾DNA,2:miR-150KO鼠尾DNA

图1鼠尾组织DNA提取

2.2PCR基因鉴定用以上提取的鼠尾组织DNA作为模板，进行PCR扩增。结果表明, WT小鼠产生长度为866bp的唯一DNA片段，而miR-150KO产生长度为262bp 的唯一DNA 片段见图2。

注：M:DNA maker,1: WT小鼠,2: miR-150KO小鼠

图2鼠尾DNA PCR扩增

3讨论

随着人类基因组DNA序列测定的完成，特异基因功能鉴定已成为当前人类功能基因组学的首要任务，而采用特异基因敲除小鼠进行该基因在各个组织、器官的功能鉴定是目前最有效的手段之一[2]。由于特异基因敲除小鼠常采用同系基因小鼠作为正常对照，基因敲除小鼠和与之对应的正常小鼠从外观上很难区分，因此，从基因水平进行用特异基因敲除小鼠的鉴定是功能实验开始的首要任务。

miR-150是一种在免疫系统高表达的微小RNA，然而其对免疫系统发育和功能的影响尚有待进一步深入研究[3]。miR-150基因敲除小鼠采用loxP-Cre基因敲除系统制备，即首先在miR-150基因位点两侧插入loxP位点，然后通过与表达Cre酶的小鼠交配，产生特异敲除miR-150基因的子代小鼠。正常小鼠包含完整的miR-150基因，PCR扩增产生长度为866 bp的DNA片段，而miR-150基因敲除小鼠则产生长度为262bp的片段[4]。

在此实验中，笔者尝试使用了快速DNA提取方法(quick“dirty”DNA preparation)，即在强碱条件下加热鼠尾组织1h，裂解细胞核变性DNA后进行基因鉴定。而传统的提取DNA鉴定方法多采取酚/氯仿抽提方法[5]：即先把鼠尾放到含有蛋白酶K的组织裂解液当中孵育过夜，然后采用酚/氯仿抽提去除蛋白等杂质，最后采用乙醇沉淀DNA。此方法虽能获得较纯净DNA进行后续分析，但提取DNA步骤复杂，时间长。相比较这个方法， 此次实验所用的快速DNA提取方法操作过程简便，时间短，直接以鼠尾裂解液上清作为模版进行PCR扩增能够准确鉴定miR -150基因敲除小鼠的基因型。

当前越来越多的实验室采用基因敲除小鼠进行实验，由于小鼠繁殖快，需要基因鉴定的小鼠数量多，时间要求紧，传统DNA提取方法大大限制了小鼠基因鉴定的效率。结果表明，本实验采取的方法能够显著缩短小鼠基因鉴定时间，可在其他基因敲除小鼠鉴定中应用。

参考文献

[1]刘付梅，李祥勇，周克元.miR-150与临床疾病研究的新进展[J].医学研究生学报，2014,27(2):194-198

[2]周维，付喜爱，张德显，等.基因敲除技术的研究进展[J].中国兽医杂志，2015,(3):67-69

[3]郑全辉，张爱红，郑爱华,等.MiR-150特异调控胸腺iNKT细胞的发育和成熟[J].中国免疫学杂志，2013,29(2):130-134

[4]Zheng Q1, Zhou L, Mi QS. MicroRNA miR-150 is involved in Vα14 invariant NKT cell development and function[J]. J Immunol, 2012,188(5): 2118 - 2126

[5]张丽,杨莲茹,吴绍强. 核酸提取方法的研究进展[J].中国动物检疫，2011, 28(12):75-78

(王一伊编辑)