金龙蛇颗粒对缺氧环境下胃癌BGC-823细胞上皮间质转化的影响

金龙蛇颗粒对缺氧环境下胃癌BGC-823细胞上皮间质转化的影响

徐晶钰，张璇，裴蓓，秦志丰，陆烨，魏品康*

(解放军第二军医大学长征医院中医科，上海 200003)

摘要：目的探讨金龙蛇颗粒对缺氧状态下胃癌BGC-823细胞上皮间质转化(EMT)的影响并初步研究该过程的相关机理。方法将胃癌BGC-823细胞分成3组：常氧对照组、缺氧对照组(加入150 μmol/L的CoCl2)、金龙蛇颗粒含药血清组。观察3组细胞形态变化；RT-PCR检测3组细胞E-cad、N-cad、Vimentin mRNA表达变化。结果常氧对照组的胃癌BGC-823细胞排列较致密，为上皮样表现；缺氧对照组大部分细胞排列较前松散，形态较前拉长，呈间质样表现；金龙蛇颗粒含药血清组介于二者之间。金龙蛇颗粒含药血清组与缺氧对照组相比，E-cad mRNA表达升高，N-cad、Vimentin mRNA表达降低，差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论金龙蛇颗粒可抑制缺氧环境中胃癌BGC-823细胞的上皮间质转化，可能与其下调N-cad、Vimentin mRNA表达，升高E-cad mRNA表达相关。

关键词：金龙蛇颗粒;E-cad;N-cad;Vimentin;上皮间质转化;缺氧;大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.08.023

中图分类号：R273文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)08-0830-03

基金项目:国家自然科学基金(81302933，81202678)；上海市中医药事业发展3年行动计划(ZYSNXD-CC-ZDYJ024)；第二军医大学青年启动基金(2012QN17)资助。

作者简介:徐晶钰(1983-)，男，硕士，主治医师，主要从事中西医结合肿瘤防治。

收稿日期:(责任编辑：赵玉芝2014-12-21)

*通信作者:魏品康，电话-(021)81885474，电子信箱-zhangxuan0918@163.com

Jinlongshe Granules on epithelial-mesenchymal transition in gastric

cancer cells BGC-823 under hypoxia microenvironment

XU Jingyu,ZHANG Xuan,PEI Bei,QIN Zhifeng,LU Ye,WEI Pinkang*

(Department of Traditional Chinese Medicine,Changzheng Hospital Affiliated to Second Military

Medical University,Shanghai 200003,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Jinlongshe granules on EMT of gastric cancer cell BGC-823 under the microenvironment of hypoxia,and to explore the mechanism of the process.MethodsThe cells were divided into three groups:normal control group(cultured under normal condition);hypoxia control group(cultured with CoCl2);Jinlongshe granules group(co-cultured with CoCl2 and Chinese herbal medicine serum).Microscopy was used to observe the different morphological change among the three groups and E-cad,N-cad,Vimentin mRNA were detected by RT-PCR.ResultsThe cells of normal control group became close together like epithelial features;the cells of hypoxia control group became loose like mesenchymal features;the result of Jinlongshe granules group was between the other two groups.RT-PCR showed that the E-cad mRNA of Jinlongshe granules group was raised significant and the N-cad,Vimentin mRNA of Jinlongshe granules group was reduced significant compared with hypoxia control group (P<0.01).ConclusionJinlongshe granules can inhibit the EMT of gastric cancer cell BGC-823 under the microenvironment of hypoxia.The mechanism maybe related to the reduction of N-cad,Vimentin mRNA and raise of E-cad mRNA.

Keywords:Jinlongshe granules;E-cad;N-cad;Vimentin;epithelial-mesenchymal transition;hypoxia;rat

胃癌是国内常见的恶性肿瘤，发病率高居第二位[1]。由于发病时多处于中晚期，其主要治疗方式为手术和化疗，疗效始终不能令人满意[2]。原发灶的侵袭转移是致死和导致生活质量下降的重要原因[3]。中医药在胃癌辅助治疗上具有明显的优势，可以对患者整体调节，改善体内环境，毒副作用小，因此研究有效的复方制剂势在必行[4]。金龙蛇制剂是我科治疗胃癌的经验方，以消痰散结为治则，由魏品康教授经40余年临床经验总结而成，疗效确切[5]。本研究将从缺氧环境中胃癌细胞上皮间质转化角度，进一步对金龙蛇颗粒逆转胃癌细胞侵袭转移的作用机制进行探讨。

1实验材料

制南星、制半夏、山慈菇等中药材均购自上海雷允上中药饮片药材有限公司，符合2010年版《中华人民共和国药典》检测标准，由第二军医大学附属上海长征医院制剂室制成含生药材53.3 g/mL的浸膏；CoCl2来自Sigma公司；E-cad抗体、N-cad抗体、Vimentin抗体均来自Abcam公司。二氧化碳培养箱来自SANYO；倒置显微镜来自重庆光电有限公司；酶标仪来自普朗DNM-9602。清洁级雄性SD大鼠,280～320 g，由中科院上海试验动物中心提供，许可证号:SCXK(沪)：2012-0002；胃癌BGC-823细胞，由中科院上海细胞库提供。

2实验方法

2.1金龙蛇颗粒含药血清的制备大鼠随机分为金龙蛇颗粒组和空白对照组,各5只。金龙蛇颗粒组予中药浸膏21.36 g/kg灌胃，每天早8点，午1点；空白对照组每次给予生理盐水2 mL。连续给药5 d，末次给药后1 h，麻醉大鼠，摘眼球取血，采血前禁食不禁水12 h,室温下静置1 h，5 000 r/min，10 min离心，56 ℃水浴灭活30 min，过滤分装采用0.22 μm滤膜，存放于-20 ℃。

2.2细胞分组胃癌细胞复苏，密度调至1×106个/mL后均匀接种于96孔培养板中,培养于37 ℃、5%CO2、含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中。常氧对照组:继续培养24 h；缺氧模型组:用150 μmol/L CoCl2加入培养基中，再继续培养24 h；金龙蛇颗粒含药血清组：先加入含药血清，再用150 μmol/L CoCl2处理胃癌细胞，置于培养箱内培养。

2.3观察胃癌BGC-823细胞形态变化按上述分组，倒置显微镜观察细胞形态变化。RT-PCR检测各组细胞E-Cad、N-cad、Vimentin mRNA表达，按RT-PCR试剂盒说明书进行操作。根据说明书提取RNA，实时定量PCR检测各目标基因mRNA。内参选用GAPDH，由上海Invitrogen公司设计合成引物。引物序列见表1。

表1　各基因PCR引物序列

3实验结果

3.1倒置显微镜观察胃癌BGC-823细胞形态变化常氧对照组细胞排列较致密，大部分为上皮细胞表现，缺氧对照组大部分细胞排列较前松散，形态有所改变，较前拉长，呈间质样表现。金龙蛇颗粒含药血清组介于二者之间。

3.2RT-PCR检测金龙蛇颗粒对胃癌BGC-823细胞E-Cad、N-cad、Vimentin mRNA表达的影响见表2。

组 别E-CadN-cadVimentin常氧对照组 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 缺氧对照组 0.32±0.03#1.65±0.07#1.80±0.08#金龙蛇颗粒血清组0.63±0.05△1.33±0.07△1.39±0.07△

注：与常氧对照组比较，#P<0.01；与缺氧对照组比较，△P<0.01

缺氧对照组与常氧对照组E-cad mRNA表达比较明显降低，N-cad、Vimentin mRNA表达比较明显升高，差异有统计学意义；金龙蛇颗粒含药血清组与缺氧对照组相比，E-cad mRNA表达升高，N-cad、Vimentin mRNA表达降低，差异有统计学意义。

4讨论

由于肿瘤恶性增殖，新生血管生成相对不足，使整个肿瘤处于缺氧环境中[6]。缺氧容易导致肿瘤细胞发生上皮间质转化[7]，而上皮间质转化又是肿瘤细胞侵袭转移的重要前提[8]。因此从上皮间质转化入手，探讨抑制胃癌侵袭转移具有十分明确的现实意义。

细胞发生上皮间质转化需要特征[9]:1)细胞形态的改变。由紧密排列的立方上皮样细胞向松散的纺锤间质细胞转变；2)上皮标记物向间质标记物的转变。E-cad表达的丧失标志着细胞发生EMT[10];而间质特性的标记物N-cad、Vimentin表达的增高意味着细胞运动能力提高，则更容易发生侵袭转移[11]。

我科前期已经就“从痰论治胃癌”做了大量研究。魏品康教授在经典痰证理论上进行创新，提出肿瘤“痰污染”学说，并认为肿瘤缺氧微环境也属于“痰污染”[12]，以消痰散结为治则的金龙蛇颗粒可以清除痰污染，对胃癌疗效确切[13]。实验上可以干扰胃癌细胞增殖[14]；促进胃癌细胞凋亡[15]；抑制胃癌侵袭转移[16]；影响胃癌新生血管生成[17]等；临床上可以延长患者生存期，提高患者生活质量[18]等。

相对于缺氧对照组，金龙蛇颗粒不仅能使胃癌细胞形态变化发生部分逆转，细胞间的联接由松散变得致密；同时也使上皮间质转化过程中的上皮样标记物(E-cad)有所提高，间质样标记物(N-cad、Vimentin)有所降低，证实了金龙蛇颗粒能逆转缺氧环境中胃癌细胞上皮间质转化。

在今后的研究中，我们将进一步探讨金龙蛇颗粒逆转缺氧环境中胃癌细胞上皮间质转化的机理，这将对从痰论治胃癌侵袭转移提供新的实验依据。

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