沉默GRP78/BIP表达对人膀胱癌T24细胞侵袭及迁移的影响及机制①

伍家燕　樊建军　曾　帆　李海玉　李　韵　张寒韬　白　鑫　刘革力　宋方洲

(重庆医科大学基础医学院分子肿瘤研究中心,重庆400016)

[摘　要]　目的：探讨体外沉默葡萄糖调节蛋白GRP78/BIP表达对膀胱癌T24细胞侵袭及迁移的影响及可能机制。方法：设计、合成靶向GRP78基因的小干扰RNA，利用脂质体Liopfecta mineRNAIMAX转染入膀胱癌T24细胞，分别采用Real-time PCR、Western blot在mRNA和蛋白水平检测细胞内GRP78、MMP2、MMP9、Timp-2表达，采用Transwell实验及细胞划痕实验检测沉默GRP78表达对膀胱癌T24细胞侵袭及迁移的影响。结果：实验(siRNA-GRP78)T24细胞中GRP78表达显著降低，细胞侵袭迁移能力明显受到抑制，MMP2、MMP9表达降低，而Timp-2表达增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：沉默GRP78能明显抑制人膀胱癌细胞的侵袭、迁移能力，其机制可能与影响MMP2、MMP9、Timp-2表达相关。

[关键词]　GRP78；膀胱癌；侵袭与迁移

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.010

·生物治疗·

沉默GRP78/BIP表达对人膀胱癌T24细胞侵袭及迁移的影响及机制①

伍家燕樊建军曾帆李海玉李韵张寒韬白鑫刘革力宋方洲

(重庆医科大学基础医学院分子肿瘤研究中心,重庆400016)

[摘要]目的：探讨体外沉默葡萄糖调节蛋白GRP78/BIP表达对膀胱癌T24细胞侵袭及迁移的影响及可能机制。方法：设计、合成靶向GRP78基因的小干扰RNA，利用脂质体Liopfecta mineRNAIMAX转染入膀胱癌T24细胞，分别采用Real-time PCR、Western blot在mRNA和蛋白水平检测细胞内GRP78、MMP2、MMP9、Timp-2表达，采用Transwell实验及细胞划痕实验检测沉默GRP78表达对膀胱癌T24细胞侵袭及迁移的影响。结果：实验(siRNA-GRP78)T24细胞中GRP78表达显著降低，细胞侵袭迁移能力明显受到抑制，MMP2、MMP9表达降低，而Timp-2表达增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：沉默GRP78能明显抑制人膀胱癌细胞的侵袭、迁移能力，其机制可能与影响MMP2、MMP9、Timp-2表达相关。

[关键词]GRP78；膀胱癌；侵袭与迁移

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.010

中图分类号①本文为高等学校博士学科点专项科研基金(No.20125503110012)。

作者简介：伍家燕(1989年-)，女，主要从事肿瘤细胞生物学研究。

通讯作者及指导教师：宋方洲(1957年-)男，教授，博士生导师，主要从事肿瘤细胞生物学、基因治疗的研究，E-mail:fzsongcq@163.com。

[Abstract]Objective:To investigate effect of silencing GRP78 in the invasion and metastasis of Bladder cancer T24 cells and the possible mechanism.Methods: The siRNA targeting GRP78 gene was chemically synthesized,and transfect into human bladder cancer T24 cells by Liopfecta mineRNAIMAX.The mRNA and protein expression levels of GRP78,MMP2,MMP9 and Timp-2 were detected by Real-time PCR and Western blot.Transwell assay and Scratch Wound Assay were conducted to deter mine the potency of migration and invasion of T24 cells.Results: The expression of AEG1 mRNA and protein were significantly down-regulated in T24 cells transfected with siRNA targeting GRP78 as compared with the control group(P< 0.01);so was expression levels of MMP2 and MMP9 protein(P< 0.05);but timp-2 expression was up-regulated.Cell migration and invasion capacity of T24 cells tranfected with GRP78siRNA group had lower than the cells in the transfection with siRNA-control group(P<0.05).Conclusion: GRP78 functions as a positive regulator in the invasion and metastasis of bladder cancer cells,and may be involved in the expression of MMP2,MMP9 and Tipm-2.

Effect of GRP78 silencing on invasion and migration abilities of human Bladder cancer T24 cells

WUJia-Yan,FANJian-Jun,ZENGFan,LIHai-Yu,ZHANGHan-Tao,BAIXin,LIUGe-Li,SONGFang-Zhou.MolecularMedicineandTumorResearchCenter,BasicMedicalCollege,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China

[Key words]GRP78；Bladder cancer；Invasion and migration

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，占我国泌尿生殖系统肿瘤发病率的第一位[1]。资料显示膀胱癌的发病率与患者的年龄、性别、职业密切相关，而复发与转移则是导致膀胱癌患者总体病死率居高不下的首要原因[2]。因此，针对寻找和开发新的膀胱癌治疗的方法和分子靶点是当前研究的重要课题。

葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein，GRP78)作为内质网分子伴侣，主要存在于内质网中，协助蛋白的折叠、合成以及转运，同时其参与了细胞的应激反应以及免疫应答等过程[3,4]。近几年来研究发现GRP78与肿瘤的发生、发展密切相关，在乳腺癌、结肠癌、胰腺癌及食管癌等肿瘤发现其呈高表达趋势[5-7]，且与肿瘤的分级与临床分期显著相关[8]，而针对GRP78生物学功能研究已经引起众多学者的广泛重视。 康郑军等研究发现淫羊藿苷(Icariin，ICA)可通过抑制GRP78的表达进而促进人膀胱癌BIU87细胞凋亡[9]，然而GRP78在膀胱癌细胞中具体作用及机制却鲜为人知，本研究在人膀胱癌T24细胞中通过靶向沉默GRP78表达，探讨其对侵袭迁移能力的影响及可能机制，为膀胱癌的早期诊断及基因靶向分子治疗提供理论依据。

1材料与方法

1.1主要试剂Lipofecta mineRNAIMAX转染试剂购自美国Invitrogen公司，TotalRNA提取试剂盒购自美国Omega公司，RNA逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司,蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物，兔抗人GRP78一抗购自美国Abcam公司，兔抗人MMP2、MMP9一抗购自美国Santa Cruz公司，兔抗人Timp-2一抗购自武汉博士德生物公司，GAPDH一抗购自北京鼎国生物技术有限公司，ECL发光试剂盒购自美国Thermo公司。GRP78-siRNA序列(5′-AUAACAUUUAGGCCAGCAAUAGUUC-3′)由上海吉玛公司合成。

1.2细胞培养与转染人膀胱癌T24细胞由重庆医科大学第一附属医院肿瘤研究中心储存，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2培养箱中培养。转染前消化收集细胞计数3×105个提前24 h接种入6孔培养板中，当细胞融合达到70%~80%时按脂质体Lipofecta mineRNAIMAX说明书分别转染siRNA-NC和siRNA-GRP78，培养48 h提取Total RNA，72 h提取总蛋白。

1.3Real-time PCR法细胞转染48 h后分别提取各组细胞的总RNA，反转录获得cDNA，用于扩GRP78目的片段的上游引物为：5′-GAAACTGCCGAGGCGTAT-3′,下游引物为：5′-ATGTTCTTCTCTCCCTCTCTCTTA-3′；β-actin上游引物为：5′-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3′，β-actin上游引物为：5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性5 s，58℃退火15 s，72℃延伸15 s，39个循环。采用2-△△Ct法计算并分析。

1.4Western blot法细胞转染72 h后分别提取各组细胞的总蛋白，加入适量的上样缓冲液，100℃煮沸变性5 min，采用50 μg上样量进行SDS-PAGE凝胶电泳，250 mA恒流电转至PVDF转印膜上，5%脱脂奶粉TBST液封闭2 h；分别将兔抗人β-actin多克隆抗体(1∶1 000)、兔抗人GRP78一抗(1∶1 000)、兔抗人Timp-2一抗(1∶500)、兔抗人MMP2一抗(1∶500)和兔抗人MMP9一抗(1∶500)4℃孵育过夜；TBST反复清洗4次，每次约10 min；羊抗兔二抗(1∶5 000)室温孵育60 min；用ECL化学发光法检测蛋白表达量。

1.5划痕实验将6孔板中转染24 h后的各组细胞，吸去培养基，用200 μl的枪头划痕，PBS冲洗3次，洗去划痕产生的细胞碎片，第二天更换无血清培养基，于镜下观察划痕愈合程度，根据收集图片数据分析实验结果。

1.6Transwell实验将4℃过夜后Matrigel胶与无血清DMEM培养基按1∶8 稀释，混匀后，在Transwell小室上室加入60 μl混合液，于孵箱静止4~6 h，将转染24 h的各组细胞消化，计数，加入含5%FBS培养基制成细胞悬液，以每孔5 000个/100 μl加入Transwell上室中，下室加入含25%FBS的培养基，培养箱孵育24 h，用棉签轻轻擦去上室细胞，PBS清洗3次，甲醇固定30 min，结晶紫染色15 min，洗净风干后，显微镜下选取随机3个视野计数并统计分析。

2结果

2.1沉默GRP78基因在膀胱癌T24细胞中的鉴定Real-time PCR、Western blot结果显示，siRNA-NC组GRP78表达水平明显高于siRNA-GRP78组，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示GRP78表达被有效沉默，见图1、2。

2.2沉默GRP78基因对细胞迁移及侵袭能力的影响

2.2.1Transwell实验结果显示，镜下siRNA-GRP78组中穿过小室基底膜的细胞明显较siRNA-NC组减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，图3,提示沉默GRP78表达可有效抑制T24细胞的侵袭能力。

图1　Real-time PCR mRNA水平检测沉默GRP78表达Fig.1　mRNA expression of silencing GRP78 was detected by Real-time PCRNote: *.P<0.05,compared with siRNA-NC group.

图2　免疫印迹法检测蛋白水平检测沉默GRP78表达Fig.2　Protein expression of silencing GRP78 was detected by Western blot

图3　沉默GRP78表达对膀胱癌T24细胞侵袭能力的影响Fig.3　Effect of silencing GRP78 expression was detected by Transwell assay on the cell invasion of bladder T24 cellsNote: *.P<0.05,compared with siRNA-NC group.

图4　沉默GRP78表达对膀胱癌T24细胞迁移能力的影响Fig.4　Effect of silencing GRP78 expression was detected by wound healing test on cell migration of bladder T24 cellsNote: *.P<0.05,compared with siRNA-NC group.

2.2.2细胞划痕实验结果显示，相同时间下siRNA-GRP78组中细胞愈合程度明显低于siRNA-NC组细胞，差异具有统计学意义(P<0.01，图4)，提示沉默GRP78表达可有效抑制T24细胞的迁移能力。

图5　沉默GRP78表达对MMP2、MMP9蛋白表达的影响Fig.5　Effects of silencing GRP78 on expression of MMP2 and MMP9 in T24 cells

图6　沉默GRP78表达对Timp-2蛋白表达的影响Fig.6　Effects of silencing GRP78 on expression of TIMP-2 protein in T24 cells

2.3沉默GRP78基因对T24细胞金属基质蛋白酶MMP2、MMP9蛋白表达的影响Western blot结果显示，与siRNA-NC组相比，siRNA-GRP78组中MMP2、MMP9蛋白表达明显减少，提示沉默GRP78表达可有效抑制MMP2、MMP9蛋白表达(图5)。

2.4沉默GRP78基因对T24细胞组织金属蛋白酶抑制剂Timp-2蛋白表达的影响Western blot结果显示，与siRNA-NC组相比，siRNA-GRP78组中Timp-2蛋白表达明显增加，提示沉默GRP78表达可促进Timp-2表达(图6)。

3讨论

肿瘤的侵袭与迁移依赖于肿瘤细胞基底膜完整性的破坏以及肿瘤微血管的形成[10]。金属基质蛋白酶(Matrix metallo-proteinases，MMPs)是一组重要的降解细胞外基质的蛋白水解酶，研究发现MMPs表达与肿瘤的侵袭与转移显著相关[11]，MMP2、MMP9是其家族重要成员，有学者证实膀胱癌组织中MMP-2、MMP-9基因的表达水平与膀胱癌组织的病理分级分期密切相关[12]，高MMP-2阳性表达率和/或低TIMP-2阳性表达率与膀胱癌浸润及转移能力增强以及术后复发呈正相关[13]。Timp-2是组织金属蛋白酶抑制剂(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)家族成员之一，可特异性结合MMPs，进而抑制MMPs的活性，Timps与MMPs的动态平衡的打破是肿瘤细胞恶性侵袭与迁移的标志[14]。

在本研究中，通过体外设计合成靶向GRP78的小干扰RNA，脂质体转染入膀胱癌T24细胞中，Transwell与划痕实验探讨了沉默GRP78表达对T24细胞侵袭与迁移的影响。结果显示，沉默GRP78表达后，siRNA-GRP78组中穿过小室基底膜的细胞量明显减少，而划痕后愈合速度也明显降低，提示沉默GRP78可有效抑制膀胱癌T24细胞的侵袭与迁移能力。而我们进一步通过免疫印迹法检测了沉默GRP78表达后，MMP2、MMP9和Timp-2蛋白的表达情况，结果显示siRNA-GRP78组中MMP2、MMP9蛋白表达明显减少，Timp-2蛋白水平明显增加，提示沉默GRP78表达可能通过调控MMP2、MMP9和Timp-2表达，进而抑制T24细胞的侵袭迁移能力，而GRP78如何通过靶定相关信号通路关键分子或转录因子来发挥调控作用，其机制有待于我们进一步的研究。

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[收稿2015-06-25修回2015-07-15]

(编辑许四平)

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