人参皂苷Rh2通过激活Gsk-3β削弱β-catenin在肝癌HepG2细胞中的作用①

石庆强　左国伟　冯子强　赵绿翠　罗　念　游智梅　夏　菁　李丹阳　李　静　陈地龙

(重庆北部新区第一人民医院急诊科，重庆401121)

①本文为国家自然科学基金(31271368)和重庆市教委基金(KJ110308)。

②重庆医科大学临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室，重庆400016。

③重庆医科大学，组织学与胚胎学教研室，干细胞与组织工程研究室，重庆400016。

陈地龙(1971年-)，男，博士，研究员，硕士生导师，主要从事中药对肿瘤的抑制作用方面的研究，E-mail: chendilong@21cn.com。

[摘　要]　目的：研究人参皂苷Rh2对HepG2细胞的作用机制。方法：用pLOV-EF1a-MCS-3FLAG-β-catenin慢病毒感染HepG2细胞，运用荧光显微镜观察细胞荧光强度变化。通过CCK-8法检测细胞增殖反应。采用FCM检测细胞周期及凋亡变化；利用ELISA法检测细胞产生Gsk-3β活性；用PCR法检测细胞Gsk-3β、β-catenin、Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3基因的表达；用CHIP法检测细胞Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3基因的表达；运用Western blot法检测细胞Gsk-3β、β-catenin、Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3蛋白的表达。结果：用pLOV-EF1a-MCS-3FLAG-β-catenin慢病毒感染HepG2细胞，被感染的HepG2细胞命名为HepG2-β-catenin；CCK-8分析结果显示，加药组给予(10~160 μmol/L)Rh2后HepG2及HepG2-β-catenin细胞的增殖受到抑制，且Rh2对肝癌HepG2-β-catenin和HepG2细胞的生长抑制呈剂量和时间依赖。在HepG2细胞中48、72 h 半数抑制率分别为100 μmol/L,58.12 μmol/L，在HepG2-β-catenin细胞中48、72 h半数抑制率分别是129.2 μmol/L，83.33 μmol/L，故Rh2作用于HepG2-β-catenin细胞浓度均高于HepG2细胞,与HepG2细胞组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。FCM检测结果显示，Rh2可诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞周期阻滞在G0/G1期，HepG2+ Rh2组G0/G1期(64.57±0.65)，而HepG2-β-catenin+ Rh2组G0/G1期(58.61±2.01)；FCM检测结果显示，Rh2可诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞早期凋亡，HepG2+ Rh2组凋亡率(17.27±2.77)，而HepG2-β-catenin+ Rh2组凋亡率(9.02±1.76)。ELISA结果显示，Rh2作用HepG2细胞12、24、48、72 h后，Gsk-3β的活性随着作用时间延长，逐渐升高，在48 h最高，随后其活性开始降低。Rh2诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞48 h，与对照组相比，Gsk-3β的活性均增高，而加入Bio后其活性降低，HepG2+ Rh和HepG2-β-catenin+ Rh2组间无明显差异；PCR、CHIP、WB结果显示，人参皂苷Rh2诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞后,Gsk-3β、Bax基因及蛋白表达增加，而β-catenin、CyclinD1、Bcl2、MMP3基因及蛋白表达水平下调。与HepG2-β-catenin+Rh2组相比,HepG2+Rh2组除Gsk-3β外各基因及蛋白的表达变化更为显著。结论：过表达β-catenin可削弱人参皂苷Rh2对肝癌HepG2细胞的药理作用。人参皂苷Rh2通过激活Gsk-3β降解β-catenin，影响下游基因的表达，促进肝癌细胞的凋亡及抑制其转移。

[关键词]　人参皂苷Rh2；HepG2；Gsk-3β；β-catenin

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.008

·中医中药与免疫·

人参皂苷Rh2通过激活Gsk-3β削弱β-catenin在肝癌HepG2细胞中的作用①

石庆强左国伟②冯子强③赵绿翠③罗念③游智梅③夏菁③李丹阳③李静③陈地龙③

(重庆北部新区第一人民医院急诊科，重庆401121)

①本文为国家自然科学基金(31271368)和重庆市教委基金(KJ110308)。

②重庆医科大学临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室，重庆400016。

③重庆医科大学，组织学与胚胎学教研室，干细胞与组织工程研究室，重庆400016。

陈地龙(1971年-)，男，博士，研究员，硕士生导师，主要从事中药对肿瘤的抑制作用方面的研究，E-mail: chendilong@21cn.com。

[摘要]目的：研究人参皂苷Rh2对HepG2细胞的作用机制。方法：用pLOV-EF1a-MCS-3FLAG-β-catenin慢病毒感染HepG2细胞，运用荧光显微镜观察细胞荧光强度变化。通过CCK-8法检测细胞增殖反应。采用FCM检测细胞周期及凋亡变化；利用ELISA法检测细胞产生Gsk-3β活性；用PCR法检测细胞Gsk-3β、β-catenin、Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3基因的表达；用CHIP法检测细胞Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3基因的表达；运用Western blot法检测细胞Gsk-3β、β-catenin、Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3蛋白的表达。结果：用pLOV-EF1a-MCS-3FLAG-β-catenin慢病毒感染HepG2细胞，被感染的HepG2细胞命名为HepG2-β-catenin；CCK-8分析结果显示，加药组给予(10~160 μmol/L)Rh2后HepG2及HepG2-β-catenin细胞的增殖受到抑制，且Rh2对肝癌HepG2-β-catenin和HepG2细胞的生长抑制呈剂量和时间依赖。在HepG2细胞中48、72 h 半数抑制率分别为100 μmol/L,58.12 μmol/L，在HepG2-β-catenin细胞中48、72 h半数抑制率分别是129.2 μmol/L，83.33 μmol/L，故Rh2作用于HepG2-β-catenin细胞浓度均高于HepG2细胞,与HepG2细胞组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。FCM检测结果显示，Rh2可诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞周期阻滞在G0/G1期，HepG2+ Rh2组G0/G1期(64.57±0.65)，而HepG2-β-catenin+ Rh2组G0/G1期(58.61±2.01)；FCM检测结果显示，Rh2可诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞早期凋亡，HepG2+ Rh2组凋亡率(17.27±2.77)，而HepG2-β-catenin+ Rh2组凋亡率(9.02±1.76)。ELISA结果显示，Rh2作用HepG2细胞12、24、48、72 h后，Gsk-3β的活性随着作用时间延长，逐渐升高，在48 h最高，随后其活性开始降低。Rh2诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞48 h，与对照组相比，Gsk-3β的活性均增高，而加入Bio后其活性降低，HepG2+ Rh和HepG2-β-catenin+ Rh2组间无明显差异；PCR、CHIP、WB结果显示，人参皂苷Rh2诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞后,Gsk-3β、Bax基因及蛋白表达增加，而β-catenin、CyclinD1、Bcl2、MMP3基因及蛋白表达水平下调。与HepG2-β-catenin+Rh2组相比,HepG2+Rh2组除Gsk-3β外各基因及蛋白的表达变化更为显著。结论：过表达β-catenin可削弱人参皂苷Rh2对肝癌HepG2细胞的药理作用。人参皂苷Rh2通过激活Gsk-3β降解β-catenin，影响下游基因的表达，促进肝癌细胞的凋亡及抑制其转移。

[关键词]人参皂苷Rh2；HepG2；Gsk-3β；β-catenin

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.008

中图分类号R735.7

文献标志码码A

文章编号号1000-484X(2015)11-1476-10

作者简介：石庆强(1986年-)，男，医师，主要从事人参对肿瘤的抑制作用方法的研究，同时就职于重庆医科大学，组织学与胚胎学教研室，干细胞与组织工程研究室，E-mail:569770664@qq.com。

通讯作者及指导教师：李静(1972年-)，女，博士，副教授，硕士生导师，主要从事中药对肿瘤的抑制作用方面的研究，E-mail: lijingyangyang@126.com.cn。

[Abstract]Objective:To investigate the inhibitory effect of Rh2 on HepG2 cells and explore the underlying mechanism.Methods: We used lentivirus carrying β-catenin to infect HepG2 cell,and detected expression of β-catenin using fluorescence microscopy.The effect of Rh2 on proliferation of HepG2-β-catenin and HepG2 cells was measured by CKK-8 assay,and flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis.The activity of Gsk-3β was checked by ELISA kit.The expression of Gsk-3β,β-catenin,Bax,Bcl2,CyclinD1,MMP3 genes were measured by qRT-PCR.In order to checked the relationship between β-catenin and TCF4,CHIP assay kit was used,the expression of Bax,Bcl2,CyclinD1,MMP3 genes were measured by PCR.The expressions of Gsk-3β,β-catenin,Bax,Bcl2,CyclinD1,MMP3 proteins were examined by Western blot.Results: HepG2 cells were successfully infected by pLOV-EF1a-MCS-3FLAG-β-catenin lentivirus,named HepG2-β-catenin.CCK-8 showed that ginsenoside Rh2 could effectively inhibit the proliferation of HepG2 and HepG2-β-catenin cells in vitro,which exhibits a dose-dependent manner at range of 10-160 μmol/L Rh2.The IC50 of Rh2 exposure on HepG2 cell for 48,72 h were 100 μmol/L and 58.12 μmol/L,but the IC50 of Rh2 exposure on HepG2-β-catenin for 48,72 h were 129.2 μmol/L,83.33 μmol/L,respectively. The IC50 of Rh2 exposure on HepG2-β-catenin cell was higher than HepG2 cell，compared with HepG2 group the differences was statistically significant(P< 0.01).Flow cytometry indicated that Rh2 could arrest HepG2 and HepG2-β-catenin cells in G0/G1 phase；the cell population in G0/G1 phase of HepG2+Rh2 group was(64.57±0.65)%,HepG2-β-catenin+Rh2 group was(58.61±2.01)%.Flow cytometry indicated that Rh2 could induced early apoptosis in HepG2 and HepG2-β-catenin cells.The apoptosis rate of HepG2 + Rh2 group was (17.27 ± 2.77)%,HepG2-β-catenin + Rh2 group(9.02 ± 1.76)%.The ELISA results indicated that HepG2 cells was induced by Rh2 for 12,24,48,72 h,the activity of Gsk-3β gradually increased，peak in 48 h，then decreased.Compared with control group,Rh2 induced HepG2 and HepG2-β-catenin cells for 48 hours,Gsk-3β activity were increased,and their activity reduced after adding Bio,there were no significant differences between HepG2+Rh2 and HepG2-β-catenin+Rh2 groups.The PCR，CHIP and WB results showed that the expression of Gsk-3β,Bax gene and proteins increased,while the β-catenin,CyclinD1,Bcl2,MMP3 gene and proteins down-regulation in HepG2 and HepG2-β-catenin cell induced by Rh2.Compared with HepG2-β-catenin + Rh2 group,the expression of other gene and proteins changed significantly,however,Gsk-3β was no significant difference.Conclusion: Over-expression of β-catenin may weaken the pharmacological effects of ginsenoside Rh2 on HepG2 cells.The activity of Gsk-3β was increased by ginsenoside Rh2 to degrade β-catenin,affecting the expression of downstream genes,promoting apoptosis of liver cancer cells and inhibiting metastasis.

Rh2 weaken effects of β-catenin on HepG2 hepatocellular carcinoma through activating Gsk-3β

SHIQing-Qiang,ZUOGuo-Wei,FENGZi-Qiang,ZHAOLÜ-Cui,LUONian,YOUZhi-Mei,XIAJing,LIDan-Yang,LIJing,CHENDi-Long.EmergencyDepartmentofFirstPeople′sHospitalofChongqingNewNorthZone，Chongqing401121,China

[Key words]Rh2；HepG2，Gsk-3β；β-catenin

肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，易于肝内转移及向肺、骨、肾、脑转移[1,2]。在中国有十分之一的人携带肝炎病毒，肝炎病毒是致癌的高危因素，而肝癌的发病率正在逐年增加[3,4]。尽管在诊断和治疗取得很大进步，但肝癌仍是癌症相关死亡的全球第三大原因。对广大肝癌患者来说，手术切除是最有效的治疗方法，但5年生存率<12%[5]。随着介入治疗的发展，使化疗药物可以直接作用于肝癌细胞，部分患者的寿命得以延长[6-8]。然而，有的肝癌患者对化疗不敏感，容易产生耐药。对于这部分患者来说，目前缺乏有效的治疗方法。因此，寻求有效的药物来提高治疗效果成为研究焦点。

越来越多的研究显示，治疗肝癌时人参成为备选药物之一，人参的预防和抗癌作用通过损伤DNA、诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖及免疫调节发挥作用[9-12]。研究证明用人参皂苷Rh2诱导SMMC-7721细胞后，可使细胞周期阻滞在G0/G1期，并减少S期和G2/M期的细胞比例。此外，人参皂苷Rh2可下调正性调控因子(CyclinD1、CyclinE)的表达，并上调负性调控因子(P16、P21基因)的表达[13]。有研究报道，人参皂甙Rh2可诱导胰腺癌细胞、肝癌细胞和A549肺癌细胞的凋亡。

Wnt信号通路的异常激活同多种恶性肿瘤如结、直肠癌，肝癌，乳腺癌，前列腺癌等发生发展有关[14]。β-catenin作为Wnt通路中重要的信号传递因子参与调节细胞的生长和增殖。研究发现，肝癌细胞中β-catenin蛋白的表达水平显著高于癌旁组织，同时，β-catenin对抗癌药物有抵抗作用。β-catenin在正常组织及癌组织中，其稳定性依赖于由Axin、APC 和 GSK-3β构成的降解复合物，主要由GSK-3β调节β-catenin在细胞内的表达水平。在无Wnt刺激下，GSK-3β作用于Axin、APC和β-catenin蛋白组成的复合物并磷酸化β-catenin，被磷酸化的β-catenin可以蛋白酶体的方式迅速降解[15]；在Wnt的刺激下，GSK-3β向细胞膜转移并与Dishevelled和LRP-5受体结合从而阻止GSK3β对β-catenin的磷酸化，其结果是β-catenin逃脱了蛋白酶体的降解，从而在胞浆累积并向胞核移位。聚集在核内的β-catenin与转录因子如LEF/TCF相互作用，启动下游靶基因的转录，如c-Myc、CyclinD1、c-jun/fra-1、uPAR、PPARδ、MMP-3、WISP等[16]。上述基因的激活会导致细胞增殖加速和向远处转移的能力增强，故GSK-3β可作为一个潜在的抗癌靶点。

糖原合酶激酶-3(Glycogen synthase kinase 3，GSK-3)是一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸激酶，在1970年被发现，是参与糖原代谢的关键酶。GSK-3由 433个氨基酸残基组成，在哺乳动物体内含有GSK-3α和 GSK-3β两种亚型，二者有类似的立体结构和底物，但其功能有所不同，其广泛存在于各种细胞中，除了其在糖原代谢中的作用，GSK-3β作为一个下游调节开关，参与多种信号转导通路调节，在胚胎发育、细胞分化、肿瘤形成等多方面发挥重要作用[17]。Tsuchiya等[18]在结肠癌细胞中发现，GSK-3β可通过降解β-catenin来抑制结肠癌细胞的生长。此外，在实体肿瘤的化疗时，影响化疗药物的敏感性和耐药性与GSK-3β活性相关。研究发现，肝癌细胞中GSK-3β蛋白的表达水平显著低于正常肝组织及癌旁组织，而且低表达的GSK-3β临床病理特征预示着预后不良[19]。我们实验室研究发现，TSPG和Rh2可抑制KG1α细胞增殖而诱导细胞凋亡，经TSPG和Rh2作用后，KG1α细胞胞核中的β-catenin蛋白明显减少，其表达区域由胞核向胞膜转移。在肝癌细胞中Rh2是否有类似的作用？而过表达β-catenin是否可以削弱Rh2这一药理作用呢？Rh2使KG1α细胞胞核中的β-catenin蛋白减少，这与GSK-3β是否有关？

因此，我们假设Rh2抗癌的作用可能是激活了GSK-3β的活性从而降解β-catenin。我们首先检测Rh2对HepG2细胞的药理作用，然后构建了过表达β-catenin的慢病毒质粒感染HepG2细胞，检验过表达β-catenin能否削弱Rh2对HepG2细胞的药理作用；再用GSK-3β抑制剂Bio[(2′Z,3′E)-6-Bromoindirubin-3′-oxime，糖原合酶激酶-3β抑制剂]来验证Rh2是否激活了GSK-3β；用PCR、CHIP、WB检测β-catenin下游基因的变化，进一步证实Rh2对HepG2细胞的药理作用可能是通过激活了GSK-3β的活性从而降解β-catenin来实现的。

1材料与方法

1.1材料人参皂苷 Rh2 购于标准物质网,纯度99%；Bio购于Sigma,人肝癌细胞 HepG2株，由左国伟教授提供，pLOV-EF1a-MCS-3FLAG质粒(re-expression β-catenin慢病毒质粒及空质粒)及293T慢病毒包装细胞由上海纽恩生物科技公司提供，DMEM-F12培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、嘌呤酶素购于HyClone；DMSO购于Merk；96孔板购于BIOFIL；Annexin V-FTIC/PI双染细胞周期凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物公司；流式细胞仪购于Becton-Dick；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、BeyoECL Puls(超敏ECL化学发光试剂盒)购于Sigma，0.45 μm PDVF膜购于Millipore公司；CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒购于DOJINDO研究所，染色质共沉淀试剂盒购于Cell Signaling Technology；PCR仪器购于美国Bio-Rad公司,倒置荧光显微镜购于日本Olympus 公司；小鼠抗人β-actin购于北京中杉金桥，兔抗人Gsk-3β、β-catenin、MMP3、TCF购于Cell Signaling Technology；兔抗人Bax、BCL2、CyclinD1购于北京鼎国生物技术有限公司；

1.2方法

1.2.1细胞培养HepG2细胞以1×105个/ml 接种于含10%血清的DMEM-F12 培养液中，在37℃、5%CO2、饱和湿度下常规培养，48～72 h传代一次。

1.2.2HepG2细胞的感染及筛选用CCK8筛选嘌呤霉素工作浓度为0.5 μg/μl。取两个一次性无菌瓶，分别接种2×105ml-1细胞。37 ℃恒温培养24 h，弃去培养基，其中一瓶中加入β-catenin慢病毒颗粒50 μl及4 mg/ml Polybrene 1 μl，另一瓶继续原条件培养。感染24 h后，用倒置荧光显微镜观察感染效果，HepG2-β-catenin感染细胞呈绿色荧光，弃去培养基，加入含有0.5 μg/μl嘌呤霉素的DMEM-F12 培养液进行筛选，获得稳定感染的HepG2-β-catenin细胞。HepG2-β-catenin细胞接种在含0.5 μg/ml嘌呤霉素的DMEM-F12培养基中，在37℃、5%CO2、饱和湿度下常规培养，48～72 h传代一次。

1.2.3CCK-8法检测细胞增殖分别取生长良好的HepG2和HepG2-β-catenin细胞以1 ×104每孔的密度接种于96孔板中，分成对照组和药物组。药物组加入不同浓度(10~160 μmol/L)人参皂苷Rh2，对照组加入含0.1% DMSO的DMEM-F12完全培养液，每孔200 μl，每药物浓度组设6个复孔。分别培养24、48、72 h后，每孔加入20 μl CCK-8液体，37℃恒温孵育3 h，用酶标仪测光吸收度值，以对照组作为100%，计算各组抑制率，抑制率(IR%)=[1-药物组(A)]/对照组(A)×100%，实验重复3次。

1.2.4流式细胞术检测细胞周期分别取对数生长期的HepG2和HepG2-β-catenin细胞接种于培养基中，分为对照组与药物组及抑制剂组，药物组加入人参皂苷Rh2(100 μmol/L)，抑制剂组加入人参皂苷Rh2(100 μmol/L)+ Bio(10 μmol/L)，以每孔3 ml的培养体系接种于6孔板，每组平行接种3个复孔，培养48 h后，收集细胞，用PBS液洗涤2次后，700 ml/L冰乙醇固定，4℃保存。流式细胞仪检测，经计算机处理分析得出细胞周期各时相比例。

1.2.5流式细胞技术检测细胞凋亡率分别取对数生长期的HepG2和 HepG2-β-catenin细胞接种于培养基中，分为对照组与药物组及抑制剂组，药物组加入人参皂苷Rh2(100 μmol/L)，抑制剂组加入人参皂苷Rh2(100 μmol/L)+Bio(10 μmol/L)，以每孔3 ml的培养体系接种于6孔板，每组平行接种3个复孔，培养48 h后，收集细胞，用流式细胞仪检测，计算机处理分析结果。

1.2.6ELISA法检测细胞Gsk-3β活性将取对数生长期的HepG2、HepG2-β-catenin细胞接种于培养基中，分为对照组与药物组及抑制剂组，药物组加入人参皂苷Rh2(100 μmol/L)，抑制剂组加入人参皂苷Rh2(100 μmol/L)+Bio(10 μmol/L)，作用48 h，收集各组细胞并提取蛋白，提取步骤依照说明书操作。在96孔酶标板上，空白孔中加入样品稀释液100 μl，余孔分别加入标准品或待测样品100 μl，把样品加于酶标板孔底部，轻轻振荡，混匀，用覆膜盖上酶标板，放入37℃恒温箱中120 min。移去液体，用力甩干。取100 μl生物素标记抗体工作液加入上述各孔，放入37℃恒温箱中60 min。用力甩去孔内液体，每孔加入PBS 溶液350 μl，浸泡2 min，洗3次，用力甩干，每孔加入100 μl辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，放入37℃恒温箱中60 min后，去除孔内液体，用力甩干，每孔加入PBS 溶液350 μl，浸泡2 min，洗5次，用力甩干。依次每孔加入90 μl底物溶液，在37℃条件下，避光显色30 min，每孔加入50 μl终止溶液，终止反应，测量各孔的光密度(OD值)。

1.2.7PCR法测HepG2、 HepG2-β-catenin细胞中Gsk-3β、β-catenin、Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3基因的表达实验分为6组：HepG2-β-catenin、HepG2-β-catenin+Rh2、HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio、HepG2、Rh2、Rh2+Bio。收集各处理组细胞，提取总的RNA，逆转录成功后进行定量分析。β-actin:Forward：5′-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′；Reverse：5′-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3′。β-catenin：Forwa-rd:5′-CGCCAGGGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC-GAC-3′；Reverse-5′-TAATACGACTCACTAGAGGG-3′。 Gsk-3β：Forward：5′-GGATTCGTCAGGAACAGGACA-3′；Reverse：5′-TTAGCATCTGACGCTGCTGT-3′。 Bcl2：Forward：5′-GGTGAACTGGGGGAGGATTG-3′；Rev erse：5′-GGCAGGCATGTTGACTTCAC-3′。 CyclinD1：Forward：5′-CATGGAGAGACAGACAGAGCA-3′；Re verse：5′-TATCCACGGGGCTGTTCCTA-3′。 Bax：Forw ard:5′-TTCATCCAGGATCGAGCAGG-3′；Reverse：5′-CTTGGTGGACGCATCCTGAG-3′。 MMP3:Forward:5′-TAATGGAGATGCCCACTTTGATG-3′；Reverse：5′-GAGTGAAAGAGACCCAGGGAGTG-3′。

1.2.8CHIP-PCR法检测HepG2、 HepG2-β-catenin细胞中Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3基因的表达实验分为6组：HepG2-β-catenin、HepG2-β-catenin+ Rh2、HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio、HepG2、Rh2、Rh2+Bio。在含有9ml培养基的各组细胞培养瓶中(75 cm2)分别加入243 μl 37%甲醛，使甲醛终浓度为1%，放入37℃恒温箱中孵育10 min。终止交联：在细胞培养瓶中加入450 μl 2.5 mol/L甘氨酸，调整甘氨酸至终浓度为0.125 mol/L，轻轻摇晃，室温放置5 min。倒掉培养基，用预冷的PBS洗细胞2次，用力使用细胞刮刀刮瓶底，并加入8 ml PBS，用移液管移入15 ml离心管中，2 000 r/min 5 min，离心，收集细胞。弃去上清，根据细胞数量，加入 400 μl SDS Lysis Buffer。调整细胞终浓度为每100 μl含1×106个细胞，再加入蛋白酶抑制剂复合物。超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，10 s间隙，共12次。除杂及抗体哺育：超声破碎结束后，1 000 r/min 4℃离心，10 min，去除不溶物质。取3个EP管，分别加入100 μl上清液，实验组加入抗体，对照组不加抗体，电泳组则加入4 μl 5 mol/L NaCl，65℃恒温箱中孵育3 h解交联，在SDS凝胶上电泳，检验超声破碎的效果。在实验组和对照组中分别加入900 μl CHIP Dilution Buffer和20 μl 50×PIC。再次加入60 μl Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃，慢速颠转1 h。4℃，静置10 min，700 r/min离心1 min，取上清。各留取20 μl作为input。实验组加入1 μl 抗体，对照组则不加抗体，在4℃条件下颠转过夜。洗沉淀复合物和解交联：免疫复合物的沉淀及清洗，孵育过夜后，每管加入60 μl Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。在4℃条件下颠转2 h。4℃，静置10 min后，700 r/min离心1 min。除去上清。依次用下列溶液(①low salt wash buffer--one wash，②high salt wash buffer--one wash，③LiCl wash buffer--one wash，④TE buffer--two wash )清洗沉淀复合物。加入溶液，4℃，颠转10 min，4℃，静置10 min，700 r/min离心1 min，弃去上清。清洗完毕后，每管加入洗脱液(10%SDS，1 mol/L NaHCO3， ddH2O)250 μl，室温下颠转15 min，静置离心，收集上清。重复洗涤一次。每管洗脱液为500 μl。解交联：每管中加入20 μl 5 mol/L NaCl(NaCl终浓度为0.2 mol/L)。吹打混匀，65℃解交联过夜。DNA样品的回收：解交联结束后，实验组和对照组加入1 μl RNaseA(MBI)，37℃恒温孵育1 h。 实验组和对照组加入10 μl 0.5 mol/L EDTA， 20 μl 1 mol/L Tris.HCl(pH6.5)，2 μl 10 mg/ml蛋白酶K，45℃处理2 h。采用omega胶回收试剂盒回收DNA片段，加入100 μl ddH2O离心，收集样品。PCR分析：操作步骤详见上述PCR的操作。

1.2.9Western blot法检测HepG2、HepG2-β-catenin细胞Gsk-3β、β-catenin、Bcl2、CyclinD1、Bax、MMP3蛋白的表达将取对数生长期的HepG2、HepG2-β-catenin细胞接种于培养基，分为对照组与药物组及抑制剂组，对照组常规培养，药物组加入人参皂苷Rh2(100 μmol/L)，抑制剂组人参皂苷Rh2(100 μmol/L)+Bio(10 μmol/L)，孵育48 h，收集各组细胞，提取蛋白。提取步骤按照说明书进行操作。测蛋白浓度，并使蛋白变性。配制胶体，电泳，电转，结束后，将膜取出并放在5%牛奶封闭液中室温封闭1.5 h；4℃下与兔抗人抗体Gsk-3β(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、Bcl2(1∶1 000)、CyclinD1、Bax(1∶1 000)、MMP3(1∶500)，鼠抗人β-actin(1∶1 000)孵育过夜；用TBST溶液漂洗后分别加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)，常温孵育1.5 h，再次用TBST漂洗，加入显色剂ECL试剂显色去曝光。

1.3统计学分析采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计处理，数据以±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1获得HepG2-β-catenin细胞用pLOV-EF1a-MCS-3FLAG-β-catenin慢病毒感染HepG2细胞，感染成功的HepG2细胞命名为HepG2-β-catenin，通过荧光显微镜观察，细胞中可见大量绿色荧光；而HepG2细胞中无荧光(图1)。用流式细胞仪检测结果显示，感染第2天细胞的感染率为94.08%,第3天感染率为99.49%(图2)。用PCR检测HepG2和HepG2-β-catenin细胞β-catenin基因的表达，与HepG2组相比，随着感染后时间延长，HepG2-β-catenin细胞β-catenin基因表达明显高于HepG2组，与HepG2组比较差异具有统计学意义(P<0.01)(图3)。

2.2Rh2对HepG2 和HepG2-β-catenin细胞增殖的抑制作用采用CCK-8法检测结果显示，对照组细胞体外生长活跃，经Rh2(10~160 μmol/L)处理，HepG2细胞增殖受到抑制，计算48、72 h 半数抑制率分别为100 μmol/L、58.12 μmol/L，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，且Rh2对肝癌HepG2细胞的生长抑制作用呈剂量和时间依赖。同时，我们也检测了Rh2对HepG2-β-catenin细胞增殖的影响，经Rh2作用48、72 h，对HepG2-β-catenin细胞的48、72 h 半数抑制率分别是129.2 μmol/L，83.33 μmol/L，Rh2作用于HepG2-β-catenin细胞的浓度均高于HepG2细胞，与HepG2组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，见图4、5。

图1　荧光显微镜观察HepG2和HepG2-β-catenin细胞β-catenin基因转染状况Fig.1　HepG2 and HepG2-β-catenin were observed by fluorescence microscopyNote: A0.HepG2-β-catenin；B0.HepG2.

图2　流式细胞术检测HepG2细胞感染率Fig.2　Rate of infection was analyzed by flow cytometryNote: B0.HepG2 cells；A0+2 day.HepG2-β-catenin cells+2 day；A0+3 day.HepG2-β-catenin +3 day.

图3　用PCR方法检测细胞β-catenin的表达Fig.3　Expression of β-catenin gene in HepG2 and HepG2-β-catenin were measured by qRT-PCRNote: B0.HepG2 cells；A0+2 day.HepG2-β-catenin cells+2 day；A0+3 day.HepG2-β-catenin +3 day.*.P<0.01.

图4　Rh2对HepG2细胞的增殖抑制作用Fig.4　Inhibitory effect of Rh2 on HepG2 cellsNote: HepG2 cells were incubated with Rh2 for 24,48,72 h and then assessed by the CKK assay.

图5　Rh2对HepG2-β-catenin细胞的增殖抑制作用Fig.5　Inhibitory effect of Rh2 on HepG2 cellsNote: HepG2-β-catenin cells were incubated with Rh2 for 24,48,72 h and then assessed by the CKK assay.

图6　Rh2对HepG2和HepG2-β-catenin细胞周期的影响Fig.6　Effect of Rh2 on HepG2 and HepG2-β-catenin cells cycleNote: HepG2-β-catenin and HepG2 cells was induced for 24 h with Rh2 or Rh2+Bio.Cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry;A0.HepG2-β-catenin；A1.HepG2-β-catenin+ Rh2 A2；HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio;B0.HepG2；B1.HepG2+ Rh2；B2.HepG2+ Rh2+Bio.

2.3Rh2对HepG2 和HepG2-β-catenin细胞周期的影响Rh2诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞周期阻滞在G0/G1期；HepG2组G0/G1期(61.02±1.48)%，HepG2+Rh2组(64.57±0.65)%，HepG2-β-catenin组(52.86±1.46)%，HepG2-β-catenin+Rh2组(58.61±2.01)%。与HepG2组相比，HepG2-β-catenin组细胞的G0/G1期(52.86+1.46)%明显低于HepG2组(61.02+1.48)%,差异有统计学意义(P<0.01)，见表1、图6。

表1　100 μmol/L Rh2对HepG2和HepG2-β-catenin细胞周期的影响(±s，n=3)Tab.1　Effect of Rh2 cell cycle of HepG2 and HepG2-β-catenin cells(±s，n=3)

表1　100 μmol/L Rh2对HepG2和HepG2-β-catenin细胞周期的影响(±s，n=3)Tab.1　Effect of Rh2 cell cycle of HepG2 and HepG2-β-catenin cells(±s，n=3)

GroupG0/G1G2/MSHepG2-β-catenin52.86±1.469.10±0.97638.03±1.84HepG2-β-catenin+Rh258.61±2.011)10.54±0.4731)30.85±2.081)HepG2-β-catenin+Rh2+Bio54.43±1.551)12.96±3.031)32.60±2.291)HepG261.02±1.482)8.12±1.0230.84±2.512)HepG2+Rh264.57±0.653)4)10.74±0.793)29.12±2.153)HepG2+Rh2+Bio60.13±3.19▽10.73±1.073)29.12±2.153)

Note：1)P<0.01 HepG2-β-catenin+ Rh2,HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio vs HepG2-β-catenin group;2)P<0.01 HepG2 vs HepG2-β-catenin;3)P<0.01HepG2+ Rh2,HepG2+ Rh2+Bio vs HepG2;4)P<0.01 HepG2+ Rh2 vs HepG2-β-catenin+ Rh2.

2.4Rh2对HepG2 和HepG2-β-catenin细胞的早期凋亡作用Rh2诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞早期凋亡。HepG2组细胞凋亡率(10.01±2.02)%，HepG2+Rh2组细胞凋亡率(17.27±2.77)%，HepG2-β-catenin组细胞凋亡率(5.26±0.50)%，HepG2-β-catenin+ Rh2组细胞凋亡率(9.02±1.76)%，HepG2-β-catenin+Rh2组细胞凋亡率低于HepG2+Rh2组细胞，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2、图7。

2.5Rh2可激活细胞Gsk-3β的活性Rh2诱导HepG2细胞12、24、48、72 h后，Gsk-3β活性逐渐升高，在48 h最高，随后其活性降低。与对照组相比，Rh2诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞48 h，Gsk-3β的活性均增高，而加入Bio后其活性降低。与Rh2组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)，而HepG2+ Rh2和HepG2-β-catenin+ Rh2组之间无差异，见图8、9。

表2　Rh2对HepG2和HepG2-β-catenin细胞早期凋亡的影响(±s，n=3)Tab.2　Effect of Rh2 on cell apoptosis of HepG2 and HepG2-β-catenin cells(±s，n=3)

表2　Rh2对HepG2和HepG2-β-catenin细胞早期凋亡的影响(±s，n=3)Tab.2　Effect of Rh2 on cell apoptosis of HepG2 and HepG2-β-catenin cells(±s，n=3)

GroupsApoptosisrate(%)HepG2-β-catenin5.26±0.50HepG2-β-catenin+Rh29.02±1.761)HepG2-β-catenin+Rh2+Bio7.02±1.211)HepG210.01±2.022)HepG2+Rh217.27±2.773)4)HepG2+Rh2+Bio12.12±0.1753)

Note：1)P<0.01 HepG2-β-catenin+ Rh2,HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio vs HepG2-β-catenin group;2)P<0.01 HepG2 vs HepG2-β-catenin;3)P<0.01 HepG2+ Rh2,HepG2+ Rh2+Bio vs HepG2;4)P<0.01 HepG2+ Rh2 vs HepG2-β-catenin+ Rh2.

图7　Rh2 对HepG2和HepG2-β-catenin细胞凋亡的影响Fig.7　Effect of Rh2 on HepG2 and HepG2-β-catenin cells apoptosisNote: HepG2-β-catenin and HepG2 cells was induced for 24 h with Rh2 or Rh2+Bio.Cell cycle distribution was analyzed by Annexin V-FTIC/PI.C0.HepG2-β-catenin；C1.HepG2-β-catenin+ Rh2；C2.HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio;D0.HepG2；D1： HepG2+ Rh2；D2.HepG2+ Rh2+Bio.

2.6Rh2对HepG2和HepG2-β-catenin细胞Gsk-3β、Bax、β-catenin、CyclinD1、Bcl2、MMP3基因表达的影响Rh2诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞后,Gsk-3β、Bax基因的表达增加，而β-catenin、CyclinD1、Bcl2、MMP3基因表达下调。与HepG2-β-catenin+Rh2组相比,HepG2+Rh2组中Bax基因表达增加更为显著；而β-catenin、Bcl2、CyclinD1、MMP3基因表则降低明显，且差异有统计学意义(P<0.01)，见图10。

2.7Rh2对HepG2和HepG2-β-catenin细胞Bax、CyclinD1、Bcl2、MMP3基因表达的影响Rh2与HepG2和HepG2-β-catenin细胞共培养后，超声破碎细胞，提出DNA，电泳验证，其分子量在100~500 bp，TCF4抗体结合DNA后用半定量PCR检测。HepG2+Rh2组和HepG2-β-catenin+Rh2组细胞中Bax基因表达增加，而CyclinD1、Bcl2、MMP3基因表达下调；与HepG2-β-catenin+Rh2相比,HepG+Rh2组中Bax基因表达增加更明显；而Bcl2、CyclinD1、MMP3基因表达降低更为明显，差异有统计学意义(P<0.01)，见图11、12。

图8　ELISA检测HepG2细胞中Gsk-3β的活性Fig.8　Activity of Gsk-3β was checked by ELISA kitNote: In treat group,the activity of GSK-3β increased with time-depend manner.*.P<0.01.

图9　ELISA检测HepG2-β-catenin 和HepG2细胞中Gsk-3β的活性Fig.9　Activity of Gsk-3β in HepG2-β-catenin and HepG2 was checked by ELISA kitNote: A0.HepG2-β-catenin；A1.HepG2-β-catenin+ Rh2；A2.HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio；B0.HepG2；B1. HepG2+Rh2；B2.HepG2+ Rh2+Bio.*.P<0.01 HepG2-β-catenin+Rh2,HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio vs HepG2-β-catenin group;#.P<0.01，HepG2+ Rh2,HepG2+ Rh2+Bio vs HepG2.

2.8Rh2对HepG2和HepG2-β-catenin细胞Gsk-3β、Bax、β-catenin、CyclinD1、Bcl2、MMP3蛋白表达的影响Rh2诱导后,HepG2和HepG2-β-catenin细胞Gsk-3β、Bax蛋白表达增加，而β-catenin、CyclinD1、Bcl2、MMP3蛋白表达下调。与HepG2-β-catenin+Rh2组相比， HepG+Rh2组细胞中Bax蛋白表达量大于HepG2-β-catenin +Rh2组；而β-catenin、Bcl2、CyclinD1、MMP3蛋白表达低于HepG2-β-catenin+Rh2组,差异有统计学意义(P<0.01)，见图13。

图10　PCR检测HepG2-β-catenin 和HepG2细胞中Gsk-3β、β-catenin Bax、Bcl2、CyclinD1、MMP3基因的表达Fig.10　Expression of Gsk-3β,β-catenin,Bax,Bcl2,CyclinD1,MMP3 genes were measured by qRT-PCRNote: A0.HepG2-β-catenin；A1.HepG2-β-catenin+ Rh2；A2.HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio；B0.HepG2；B1.HepG2+ Rh2；B2.HepG2+Rh2+Bio.*.P<0.01 HepG2-β-catenin+ Rh2,HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio vs HepG2-β-catenin group;△.P<0.01 HepG2 vs HepG2-β-catenin;▽.P<0.01HepG2+ Rh2,HepG2+ Rh2+Bio vs HepG2;#.P<0.01 HepG2+ Rh2 vs HepG2-β-catenin+ Rh2.

图11　电泳检查超声破碎的DNAFig.11　DNA electrophoresis figureNote: A0.HepG2-β-catenin；A1.HepG2-β-catenin+ Rh2；A2.HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio；B0.HepG2；B1.HepG2+ Rh2；B2.HepG2+ Rh2+Bio.

3讨论

人参作为传统中草药广泛应用于中医治疗中，近年来其有效成分用于各种肿瘤的预防与治疗[9,13]。大量研究表明，人参皂甙Rh2可显著影响并诱导胰腺癌细胞、肝癌细胞和A549肺癌细胞凋亡[12,20-22]。我们的实验研究也发现，人参皂甙Rh2可抑制HepG2肝癌细胞增殖，且呈浓度和时间依赖性。48、72 h的Rh2 IC50 分别为100 μmol/L，58.12 μmol/L。我们实验室研究发现，TSPG可抑制KG1α细胞增殖并诱导细胞凋亡，该作用机制可能与其抑制β-catenin蛋白及mRNA表达水平有关。临床研究表明，细胞过表达β-catenin对化疗或放疗有抵制作用，且预后差[18]。我们用过表达β-catenin的慢病毒感染HepG2肝癌细胞，获取HepG2-β-catenin细胞，检测结果发现，Rh2对HepG2-β-catenin细胞的增殖抑制也呈浓度和时间依赖性，但所需Rh2的浓度明显高于HepG2细胞，作用48、72 h的 Rh2 IC50分别是129.2 μmol/L、83.33 μmol/L。其结果显示，过表达β-catenin会削弱Rh2对HepG2肝癌细胞的药理作用。

图12　用半定量PCR检测Bax、Bcl2、CyclinD1、MMP3基因的表达Fig.12　Expression of Bax,Bcl2,CyclinD1,MMP3 genes were measured by PCRNote: A0.HepG2-β-catenin；A1.HepG2-β-catenin+ Rh2；A2.HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio.B0.HepG2；B1.HepG2+ Rh2；B2.HepG2+ Rh2+Bio.

图13　Western blot检测HepG2-β-catenin 和HepG2细胞中Gsk-3β、β-catenin Bax、Bcl2、CyclinD1、MMP3蛋白的表达Fig.13　Expression of Gsk-3β,β-catenin,Bax,Bcl2,CyclinD1,MMP3 protein were measured by Western blotNote: A0.HepG2-β-catenin；A1.HepG2-β-catenin+ Rh2；A2.HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio；B0.HepG2；B1.HepG2+ Rh2；B2.HepG2+ Rh2+Bio.*.P<0.01 HepG2-β-catenin+ Rh2,HepG2-β-catenin+ Rh2+Bio vs HepG2-β-catenin group;△.P<0.01 HepG2 vs HepG2-β-catenin;▽.P<0.01 HepG2+ Rh2,HepG2+ Rh2+Bio vs HepG2;#.P<0.01 HepG2+ Rh2 vs HepG2-β-catenin+ Rh2.

先前的研究结果显示，Wnt/β-catenin信号通路持续激活可促进结肠、胰腺组织肿瘤细胞的增殖和肿瘤的形成[14,23]。为了探索Rh2及过表达β-catenin对HepG2肝癌细胞周期和凋亡的影响，我们采用流式细胞术检测显示，与HepG2组细胞相比，HepG2-β-catenin组细胞G0/G1期细胞比例(52.86±1.46)%明显低于HepG2组(61.02±1.48)%，说明过表达β-catenin可对细胞周期产生影响，G0/G1期细胞比例的减少，可加速细胞的增殖。结果提示，Rh2对HepG2和HepG2-β-catenin的抗癌作用是使细胞周期阻滞于G0/G1期。同时，Rh2作用HepG2和HepG2-β-catenin细胞后，CyclinD1基因和蛋白表达水平均降低。CyclinD1作为肿瘤恶性增殖关键因子，其表达水平下调可使肿瘤细胞增殖失控得到抑制。HepG2+Rh2组细胞中CyclinD1基因和蛋白表达水平明显低于HepG2-β-catenin+Rh2组，说明过表达β-catenin可削弱Rh2下调CyclinD1基因和蛋白表达的作用。流式细胞术检测结果显示，Rh2作用后，HepG2和HepG2-β-catenin细胞凋亡率均增高，但HepG2-β-catenin+Rh2组细胞凋亡率低于HepG2+Rh2组。上述实验结果表明，过表达β-catenins可削弱Rh2对HepG2肝癌细胞生存抑制作用和降低凋亡率。

GSK-3β的异常磷酸化及失活参与肝癌的形成。本文用酶免疫吸附试验检测结果显示，Rh2均能以时间与浓度依赖方式激活HepG2和HepG2-β-catenin细胞GSK-3β活性，且两组之间无明显差异。又采用GSK-3β抑制剂Bio拮抗Rh2的作用，来验证Rh2是否激活了GSK-3β。在HepG2和HepG2-β-catenin细胞同时加入Rh2和Bio后，GSK-3β活性均有所降低，但仍然明显高于HepG2和HepG2-β-catenin细胞组，这证明Rh2可以激活GSK-3β，且此过程可以被Bio所拮抗。用PCR和Western blot法检测了Rh2诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞48 h后，GSK-3β基因和蛋白表达水平均增高，且两种细胞之间无统计学差异。以上结果说明，Rh2既激活GSK-3β的活性又能够使其表达增强。

β-catenin在正常组织及癌组织中作为一个重要的分子，它的稳定性依赖于由Axin、APC 和 GSK-3β构成的降解复合物，主要由GSK-3β去调节β-catenin在细胞内的表达水平。Rh2诱导HepG2和HepG2-β-catenin细胞48 h后，GSK-3β活性增加。用PCR和Western blot检测结果表明，与HepG2组细胞相比，HepG2+ Rh2组细胞中β-catenin基因和蛋白表达水平明显下降。同时检验结果发现，与HepG2-β-catenin组相比，HepG2-β-catenin+ Rh2组中β-catenin基因和蛋白水平有所下降，但下降幅度没有HepG2+ Rh2组明显。该结果表明，过表达β-catenin能削弱Rh2对β-catenin的降解作用，进一步证实Rh2降解β-catenin是通过激活GSK-3β的活性。

在无Wnt刺激下，GSK-3β作用于Axin、APC和β-catenin蛋白组成的复合物并磷酸化β-catenin，被磷酸化的β-catenin可以蛋白酶体的方式迅速降解[15]；在Wnt的刺激下，GSK-3β向细胞膜转移并与Dishevelled和LRP-5受体结合，从而阻止GSK3β对β-catenin的磷酸化，其结果是β-catenin逃脱了蛋白酶体的降解，因此在胞浆累积并向胞核移位。本文采用PCR检测结果显示，与HepG2组细胞相比，HepG2+ Rh2组中CyclinD1、Bcl2、MMP3表达减少，而Bax增加。前面的实验结果显示，Rh2诱导HepG2后β-catenin表达量明显下降，为了进一步探讨β-catenin进入细胞核数量减少对下游基因的影响，我们采用染色质免疫共沉淀的方法检测下游基因[24]。结果显示，Rh2诱导HepG2细胞48 h后，在HepG2+ Rh2中CyclinD1、Bcl2、MMP3表达减少，而Bax表达增加，Western blot检测结果与染色质免疫共沉淀结果一致。同时检测结果显示，HepG2-β-catenin+Rh2组细胞中Bax基因和蛋白表达增加程度与Bcl2、CyclinD1、MMP3基因和蛋白表达减少程度均明显弱于HepG2+Rh2组。该结果表明，Rh2可通过激活GSK-3β活性降解β-catenin，使进入细胞核内的β-catenin减少，进而抑制周期、增殖及迁移相关蛋白的表达，促进凋亡相关蛋白的表达，最终抑制HepG2细胞增殖，促进其凋亡；而过表达β-catenin能削弱Rh2对HepG2细胞的促凋亡作用。

Rh2抗肿瘤的作用显著，但它能否抑制肿瘤的转移尚未被证实。β-catenin是黏附分子，有关β-catenin在肿瘤细胞转移中的作用报道很少。Miyazawa等[26]人发现，在浸润性肿瘤组织中可以出现 β-catenin细胞核表达。MMP3 是降解细胞外基质的重要蛋白水解酶，主要的作用底物是Ⅳ型胶原，通过降解细胞外基质和基底膜的主要成分Ⅳ型胶原，从而参与肿瘤的浸润和转移过程。本实验Western blot和PCR检测结果显示，Rh2能够抑制HepG2细胞β-catenin和MMP3蛋白及基因的表达，结果还提示Rh2可能具有抗肿瘤转移作用。

综上所述，过表达β-catenin可削弱Rh2对肝癌HepG2细胞的药理作用。Rh2通过激活Gsk-3β降解β-catenin，影响下游基因的表达，促进肝癌细胞的凋亡及抑制其转移。

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[收稿2015-06-06修回2015-07-20]

(编辑倪鹏)