沉默NRP-1 基因对人T细胞白血病Jurkat细胞株增殖与凋亡的影响①

王红梅　徐振媛　杜秀平　李滔涛　韩正祥

(徐州医学院附属医院肿瘤科，徐州221000)

[摘　要]　目的：探讨RNAi沉默NRP-1基因对人T细胞白血病细胞株增殖与凋亡的影响。方法：将我们前期构建好的pLB-NRP-1/shRNA重组慢病毒质粒，感染至Jurkat细胞中，用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况及化疗药物表柔比星(EPI)处理后细胞增殖情况；用AV/PI法结合流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期。结果：细胞增殖结果：在48、72、96 h时间点NRP-1/shRNA干扰组的OD值均低于相应对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)；细胞凋亡率结果：与对照组比较，NRP-1/shRNA干扰组细胞的凋亡率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；对化疗药物表柔比星(EPI)敏感性检测结果：EPI浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 μg/ml时， NRP-1/shRNA干扰组的细胞生长抑制率较相应对照组高，差异皆有统计学意义(P<0.05)，并且选择IC50进行EPI诱导后，NRP-1/shRNA干扰组的细胞凋亡率明显升高，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；WB结果显示：与对照组相比，NRP-1/shRNA干扰组Bcl-2蛋白的表达水平明显下降， Bax的表达水平明显升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)；细胞周期结果：与对照组比较，NRP-1/shRNA干扰组G0/G1期细胞的比例增高，S期细胞的比例明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：RNAi沉默NRP-1基因可抑制Jurkat细胞增殖，促进其凋亡，提高对化疗药物的敏感性，其机制可能涉及Bcl-2/Bax途径的调节；并可将细胞周期阻滞在G0/G1期，降低细胞的增殖水平，诱导细胞进入凋亡期。

[关键词]　NRP-1；RNA干扰；慢病毒载体；T细胞白血病；增殖；凋亡；细胞周期；化疗药物敏感性

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.002

·基础免疫学·

沉默NRP-1 基因对人T细胞白血病Jurkat细胞株增殖与凋亡的影响①

王红梅徐振媛杜秀平李滔涛②韩正祥

(徐州医学院附属医院肿瘤科，徐州221000)

[摘要]目的：探讨RNAi沉默NRP-1基因对人T细胞白血病细胞株增殖与凋亡的影响。方法：将我们前期构建好的pLB-NRP-1/shRNA重组慢病毒质粒，感染至Jurkat细胞中，用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况及化疗药物表柔比星(EPI)处理后细胞增殖情况；用AV/PI法结合流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期。结果：细胞增殖结果：在48、72、96 h时间点NRP-1/shRNA干扰组的OD值均低于相应对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)；细胞凋亡率结果：与对照组比较，NRP-1/shRNA干扰组细胞的凋亡率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；对化疗药物表柔比星(EPI)敏感性检测结果：EPI浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 μg/ml时， NRP-1/shRNA干扰组的细胞生长抑制率较相应对照组高，差异皆有统计学意义(P<0.05)，并且选择IC50进行EPI诱导后，NRP-1/shRNA干扰组的细胞凋亡率明显升高，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；WB结果显示：与对照组相比，NRP-1/shRNA干扰组Bcl-2蛋白的表达水平明显下降， Bax的表达水平明显升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)；细胞周期结果：与对照组比较，NRP-1/shRNA干扰组G0/G1期细胞的比例增高，S期细胞的比例明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：RNAi沉默NRP-1基因可抑制Jurkat细胞增殖，促进其凋亡，提高对化疗药物的敏感性，其机制可能涉及Bcl-2/Bax途径的调节；并可将细胞周期阻滞在G0/G1期，降低细胞的增殖水平，诱导细胞进入凋亡期。

[关键词]NRP-1；RNA干扰；慢病毒载体；T细胞白血病；增殖；凋亡；细胞周期；化疗药物敏感性

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.002

中图分类号①本文为国家自然科学基金青年基金(No.30901753)和江苏省“六大人才高峰”B类资助项目(No.2014-WSW-040)。;②徐州工程兵学院门诊部，徐州221000。

作者简介：王红梅(1981年-)，女，讲师，主治医师，主要从事肿瘤分子靶向治疗及内科治疗研究，E-mail:wanghongmei8179@126.com。

通讯作者及指导教师：韩正祥(1974年-)，男，博士，教授，副主任医师，硕士生导师，主要从事肿瘤分子靶向治疗及内科治疗，E-mail:cnhzxyq@163.com。

[Abstract]Objective:To investigate the effect on proliferation and apoptosis of T-cell leukemia cells by silencing NRP-1(Jurkat cells). Methods: The lentivirus plasmid which expresses NRP1 gene specific shRNA was constructed in our preliminary experimental.We transfected the lentivirus plasmid to human T-cell Lymphoma cells.The proliferation of Jurkat cells different groups and effect on cell proliferation after chemotherapy drug EPI-treated were found by CCK-8 kit.The proliferation level and apoptosis rate of the cells were detected by flow cytometry and Annexin-V-FITC/PI method. Results: The proliferation level of NRP -1 /shRNA interference group was decreased significantly in 48 h,72 h,96 h,which was compared with the control groups.The apoptosis rate of the NRP-1/shRNA interference group was increased compared with control groups.The chemotherapy drug sensitivity of epirubicin(EPI) test results showed that EPI concentration was 0.025,0.05,0.1,0.2,0.4 μg/ml,the NRP-1/shRNA interference group of cell growth inhibition rate was increased,the corresponding control group difference had statistical significance(P<0.05).We choose the drug concentration of the EPI IC50 for next experiments.NRP-1/shRNA interference group cell apoptosis rate increased significantly after induction,compared with the control groups difference was statistically significant(P<0.05).Compared with control group，the expression level of Bcl-2 protein was decreased and the expression level of bax protein was increased significantly after EPI induction.The percentage of cells at G0/G1 phase increased significantly，while those at S phase decreased significantly .Conclusion: Plasmid shRNA-NRP1 inhibited the expression of NRP1 in Jurkat cells and decreased the proliferation level of Jurkat cells and promote their apoptosis and enhance their drug sensitivity;the molecular mechanism may relate to down-regulation of Bcl-2 and up-regulation of Bax.and arrested the cell cycle at G0/G1 phase.

Effects on proliferation and apoptosis of T-cell leukemia cells by silencing NRP-1

WANGHong-Mei,XUZhen-Yuan,DUXiu-Ping,LITao-Tao,HANZheng-Xiang.DepartmentofOncology,AffiliatedHospitalXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221000,China

[Key words]Neuropilin1(NRP1)；RNA interference；Lentivirus；T-cell leukemia；Cell proliferation；Cell apoptosis

神经纤毛蛋白(Neuropilins，NRPs)为跨膜糖蛋白，不仅是semaphorins 的主要受体；还是血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的非酪氨酸激酶受体[1]。NRPs家族有两个成员，分别是NRP1 和NRP2。NRP-1在脊椎动物胚胎的神经和心血管系统发育中发挥了重要作用，NRP-1在多种肿瘤组织中呈高表达，以独立或者依赖VEGFR-2的方式调节肿瘤血管的形成及肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移，促进多种实体瘤及血液系统肿瘤的发生和发展，并且与肿瘤患者的预后密切相关[2]。已有研究表明NRP-1在白血病细胞中有表达，急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)中NRP-1的表达较急性髓性白血病(Acute myloid leukemia，AML)中表达更多见，NRP-1的表达水平或可指示白血病的严重程度和进展[3-6]。而NRP-1作为新的VEGF受体在T细胞白血病中的表达及作用研究较少。我们前期实验成功构建了NRP-1/shRNA慢病毒表达载体，体外感染人T细胞白血病Jurkat细胞株后显著抑制靶基因NRP-1 mRNA和蛋白的表达。本研究检测NRP-1/shRNA慢病毒表达载体对Jurkat细胞增殖、凋亡、化疗药物敏感性及细胞周期的影响。现报道如下。

1材料与方法

1.1材料本研究中pLB-NRP-1/shRNA慢病毒表达载体系我们课题组前期实验构建成功并经过验证，通过WB及RT-PCR筛选出对靶基因-NRP-1沉默效率最高的慢病毒表达载体；Jurkat细胞株购于上海中科院细胞库；Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡试剂盒以及细胞周期测定试剂盒购于南京凯基生物公司；CCK-8试剂盒购于日本同仁化学研究所；RPMI1640培养基购于Gibco公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；表柔比星(EPI)由美国辉瑞制药有限公司提供；抗兔bcl-2、bax多克隆抗体购于英国Abcam公司；抗β-actin鼠单克隆抗体以及碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG、碱性磷酸酶标记马抗小鼠IgG、BCIP/NBT试剂均购于北京中杉金桥公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养人T细胞白血病细胞株Jurkat细胞常规培养(在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养)，每2~3 d传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2细胞转染及实验分组实验分三组：空白对照组：未做特殊处理的Jurkat细胞组；阴性对照组：感染非特异性shRNA慢病毒载体的Jurkat细胞组；实验组(NRP-1/shRNA干扰组)：感染了NRP-1/shRNA慢病毒载体(系前期实验筛选出NRP-1/shRNA1对NRP-1沉默效率最高)的Jurkat细胞组；每组均设3个复孔。取对数生长期Jurkat细胞，按照感染复数(MOI)为20加入浓缩的慢病毒颗粒(各设3个复孔)，并加入聚凝胺至终浓度为8 μg/ml，置于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养，于病毒感染24、48 h后荧光显微镜下观察GFP表达，感染后的阳性细胞扩大培养，流式细胞仪分选GFP阳性细胞，分选后重新扩大培养，获得稳定抑制NRP-1基因表达的Jurkat细胞模型。

1.2.3CCK-8法检测RNAi沉默NRP-1基因对细胞增殖取对数生长期细胞，调整细胞密度为5×104ml-1，接种于96孔板中(每孔100 μl)，每组设3个复孔，按前述方法常规培养，分别于培养后24、48、72、96 h加入CCK-8试剂10 μl，继续培养3 h后，于酶标仪波长450nm测OD值。

1.2.4RNAi沉默NRP-1基因对化疗药物EPI敏感性的影响取对数生长期细胞，将细胞密度为2.5×105ml-1的各组细胞，接种于96孔板(每孔100 μl)，按前述方法常规培养，培养24 h后，加入含有2.5、5、10、20、40、80 μg/ml表柔比星EPI的无血清RPMI1640培养基各1 μl，使其终浓度为以此为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/ml，每组每一浓度平行设3个复孔。加药后置于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中继续培养24 h，每孔加入CCK-8试剂10 μl，继续培养3 h，于酶标仪波长450nm测OD值。细胞生长抑制率=[(1-干扰组0D值)/对照组OD值]×100%。

1.2.5流式细胞仪检测RNAi沉默NRP-1基因对细胞凋亡的影响(Annexin V-FITC/PI标记)取对数生长期细胞，调整细胞密度为2×104ml-1，接种于六孔板中，常规培养24 h，1 000 r/min离心收集细胞，用PBS溶液洗涤细胞两次后弃上清，用500 μl Binding Buffer重悬细胞，先加入5 μl Annexin V-FITC充分混匀，再加入 5 μl PI充分混匀，在室温下避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

取对数生长期细胞，将细胞密度为2×105ml-1的各组细胞，接种于六孔板，常规中培养24 h，加入用无血清RPMI1640培养基稀释的表柔比星溶液，使其终浓度为0.23 μg/ml，每组均设3个复孔，置于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中继续培养24 h后，采用Annexin V-FITC/PI测定细胞凋亡率，方法同上。

1.2.6Western blot检测 EPI处理后细胞内凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白表达取对数生长期的细胞,将细胞密度为2×105ml-1的各组细胞,接种于六孔培养板中,常规培养24 h后，用PBS溶液洗涤后加入用无血清RPMI1640培养基稀释的表柔比星溶液，使其终浓度为0.23 μg/ml，每组均设3个复孔，继续培养24 h后，离心收集细胞提取总蛋白。将等量蛋白样品点于SDS-聚丙烯酰胺凝胶小孔进行电泳。电泳后半干转膜，将转好的NC膜用洗涤后，将NC膜浸入封闭液进行封闭，然后根据预染Marker所指示大小，将内参条带与目的条带剪开，分别加入一抗(1∶1 000抗兔bcl-2多克隆抗体；1∶1 000抗兔bax多克隆抗体；1∶5 000抗β-actin鼠单克隆抗体),4℃过夜，取出NC膜洗涤后，加入羊抗兔及羊抗鼠二抗(1∶2 000)孵育，将NC膜置于BCIP/NBT试剂中反应约1 min，置于Image Quant 4000 mini显像仪中显像，结果用bcl-2、bax与内参吸光度比值表示各样本中目的蛋白的相对含量。

1.2.7流式细胞仪RNAi沉默NRP-1基因对细胞周期的影响取对数生长期细胞，将细胞密度为2×105ml-1的各组细胞，接种于六孔板中，常规培养24 h后离心收集细胞，并用PBS溶液洗涤一次，将细胞密度调整为2×106ml-1，用预冷的70%乙醇固定，置于4℃冰箱过夜，用PBS洗去固定液，加入100 μl RNase A 37℃水浴30 min，再加入400 μl PI充分混匀，4℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

2结果

2.1细胞增殖检测CCK-8法检测细胞增殖结果显示：Jurkat细胞NRP-1/shRNA干扰组于48、72、96 h测得的OD值分别为0.242±0.033、0.415±0.028、0.806±0.064，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明干扰NRP-1基因能抑制Jurkat细胞的增殖(表1、图1)。

2.2细胞凋亡率的检测Annexin V-FITC/PI结合流式细胞仪检测凋亡率，结果显示：空白对照组、阴性对照组、NRP-1/shRNA干扰组的细胞凋亡率分别为(4.5±0.2)%、(4.1±0.4)%、(34.1±1.9)%，与对照组比较，NRP-1/shRNA干扰组的凋亡率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)(表2、图2)。

2.3化疗药物敏感性的检测CCK-8法检测干扰沉默NRP-1基因对化疗药物敏感性的影响，结果显示：选取化疗药物表柔比星(EPI)进行检测，结果显示在0.01～10 μg/ml的浓度范围内，随着EPI药物浓度的升高，其对细胞生长抑制作用逐渐增强，其中在0.025～1 μg/ml的范围内最明显。对照组细胞在EPI浓度为0.2 μg/ml时，细胞生长抑制率为(48.83±1.46)%，IC50约为0.23 μg/ml；而NRP-1/shRNA干扰组在EPI浓度为0.1 μg/ml时细胞生长抑制率达(44.27±1.25)%，IC50约为0.15 μg/ml，比对照组的IC50低；EPI浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 μg/ml时，与对照组比较，NRP-1/shRNA干扰组的细胞生长抑制率高，差异有统计学意义(P<0.05)(表3、图3)。

图1　各组细胞增殖水平Fig.1　Cell proliferation levels of different groups

表2　各组细胞的凋亡率(%,±s，n=3)Tab.2　Cell apoptosis levels of different groups(%,±s，n=3)

表2　各组细胞的凋亡率(%,±s，n=3)Tab.2　Cell apoptosis levels of different groups(%,±s，n=3)

BlankcontrolgroupNegativecontrolgroupNRP-1/shRNAgroupApoptosisrate(%)4.5±0.24.1±0.434.1±1.91)

Note：1)P<0.05 vs negative control group.

表1　CCK-8法检测干扰NRP-1基因对Jurkat细胞增殖的影响(±s，n=3)Tab.1　Inhibitory effect of NRP-1/shRNA on proliferation of Jurkat cells by CCK-8(±s，n=3)

表1　CCK-8法检测干扰NRP-1基因对Jurkat细胞增殖的影响(±s，n=3)Tab.1　Inhibitory effect of NRP-1/shRNA on proliferation of Jurkat cells by CCK-8(±s，n=3)

Groups24h(OD)48h(OD)72h(OD)96h(OD)Blankcontrolgroup0.217±0.0130.444±0.0060.732±0.0211.607±0.137Negativecontrolgroup0.197±0.0490.478±0.0190.800±0.0541.634±0.140NRP-1/shRNAgroup0.122±0.0080.242±0.0331)0.415±0.0281)0.806±0.0641)

Note：1)P<0.05，vs negative control group.

图2　流式细胞仪检测各组Jurkat细胞的凋亡率Fig.2　Cell apoptosis levels of different groups by FCMNote: A.Blank control group；B.Negative control group;C.NRP-1/shRNA group.

2.4EPI诱导的细胞凋亡率检测根据2.3实验结果，Jurkat细胞EPI IC50约为0.23 μg/ml，故本实验EPI浓度选择0.23 μg/ml。采用Annexin V-FITC/PI结合流式细胞仪检测凋亡率，结果显示：对照组、NRP-1/shRNA干扰组的细胞凋亡率分别为(17.9±2.46)%、(47.4±2.16)%，与对照组比较，NRP-1/shRNA干扰组的凋亡率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)(表4、图4)。

2.5EPI处理后细胞内凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白表达水平的变化WB结果显示：与对照组相比，NRP-1/shRNA干扰组抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表达水平下降，为对照组1/3；与对照组相比，NRP-1/shRNA干扰组促凋亡基因Bax的表达水平升高，升高约2倍，差异均有统计学意义(P<0.05)；提示NRP-1基因干扰后增加细胞对表柔比星敏感性的机制可能涉及Bcl-2/Bax途径的调节(表5、图5)。

表3　不同浓度的EPI处理后对各组Jurkat细胞增殖的影响(±s，n=3)Tab.3　Effect on cell proliferation of different groups after chemotherapy drug EPI-treated(±s，n=3)

表3　不同浓度的EPI处理后对各组Jurkat细胞增殖的影响(±s，n=3)Tab.3　Effect on cell proliferation of different groups after chemotherapy drug EPI-treated(±s，n=3)

EPIconcentration(μg/ml)0.0250.050.10.20.40.8Negativecontrolgroup1.37±0.196.78±0.2720.13±1.4648.83±1.4672.19±3.0291.36±4.45NRP-1/shRNAgroup7.50±0.571)21.57±1.451)44.27±1.251)69.66±2.271)87.22±1.761)96.06±1.70

Note：1)P<0.05 vs negative control group.

图3　EPI处理后各组Jurkat细胞生长抑制曲线Fig.3　Growth-inhibitory curves of different groups after chemotherapy drug EPI-treated

表4　EPI处理后Jurkat细胞的凋亡率(%，±s，n=3)Tab.4　Apoptosis rate of Jurkat cells of different groups after chemotherapy drug EPI-treated(%，±s，n=3)

表4　EPI处理后Jurkat细胞的凋亡率(%，±s，n=3)Tab.4　Apoptosis rate of Jurkat cells of different groups after chemotherapy drug EPI-treated(%，±s，n=3)

NegativecontrolgroupNRP-1/shRNAgroupApoptosisrate(%)17.9±2.4647.4±2.161)

Note：1)P<0.05 vs.negative control group.

图4　流式细胞仪检测EPI处理后Jurkat细胞的凋亡率Fig.4　Apoptosis rate of Jurkat cells of different groups after EPI-treated by FCMNote: A.Negative control group after EPI-treated;B.NRP-1/shRNA group after EPI-treated.

表5　EPI处理后细胞内凋亡相关基因蛋白的表达(±s，n=3)Tab.5　Protein expression of apoptotic related genes protein after EPI-treated(±s，n=3)

表5　EPI处理后细胞内凋亡相关基因蛋白的表达(±s，n=3)Tab.5　Protein expression of apoptotic related genes protein after EPI-treated(±s，n=3)

BlankcontrolgroupNegativecontrolgroupNRP-1/shRNAgroupBcl-21.000±0.0560.946±0.0910.324±0.0821)Bax1.000±0.0681.031±0.0712.032±0.2371)

Note：1)P<0.05 vs.negative control group.

图5　EPI处理后细胞内凋亡相关基因蛋白的表达情况Fig.5　Protein expression of apoptotic related genes protein after EPI-treated

表6　干扰NRP-1基因对Jurkat细胞的细胞周期的影响(%，±s，n=3)Tab.6　Effects on Jurkat cells of cell cycle(%，±s，n=3)

表6　干扰NRP-1基因对Jurkat细胞的细胞周期的影响(%，±s，n=3)Tab.6　Effects on Jurkat cells of cell cycle(%，±s，n=3)

GroupsG0/G1cycle(%)Scycle(%)G2/Mcycle(%)Negativecontrolgroup51.19±5.6241.01±1.018.00±0.77NRP-1/shRNAgroup61.70±2.021)30.91±0.911)8.00±0.55

Note：1)P<0.05 vs.negative control group.

图6　干扰NRP-1基因对Jurkat细胞的细胞周期的影响Fig.6　Effects on Jurkat cells of cell cycleNote: A.Negative control group;B.NRP-1/shRNA group.

2.6细胞周期的检测采用检测细胞DNA含量的方法检测细胞周期，结果如下：与对照组比较，NRP-1/shRNA干扰组G0/G1期细胞的比例增高，S期细胞的比例明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明干扰NRP-1基因能将细胞进程阻滞在G0/G1期(表6、图6)。

3讨论

NRP1基因表达广泛，在多种肿瘤细胞中表达升高，与肿瘤的发生发展密切相关，与VEGF-A、B、E 及胎盘生长因子相互作用[7，8]，不仅可以增强VEGF 与VEGFR-2 结合引起的生物活性，而且可以单独表达在内皮、肿瘤、基质细胞上，独立介导促血管生成作用以及抗凋亡作用[9，10]。Russo等[11]报道某些不表达VEGFR，而表达NRP1 的肿瘤细胞中，NRP1 也可与VECF 结合诱导肿瘤细胞增殖，在肿瘤血管新生及侵袭转移中发挥作用。

细胞的增殖和凋亡异常与肿瘤的发生密切相关，本实验研究结果显示RNAi 沉默NRP-1 基因不仅能促进细胞凋亡，更可以抑制细胞增殖。Li 等[12]应用RNAi 沉默NRP-1 基因能显著抑制人脑胶质瘤细胞的增殖，促进其凋亡。Bachelder等[13]研究发现，NRP-1 在转移性乳腺癌中表达，而在非转移性乳腺癌中无表达；而转染了NRP-1基因的非转移性MDA-MB-453 乳腺癌细胞的缺氧性凋亡明显减少，提示NRP-1对促进乳腺癌细胞生长、抑制其凋亡有特殊作用。 Meyerson等[5]发现VEGF165能够诱导髓细胞白血病-1(Myeloid cell leukemia-1，MCL-1)mRNA的表达，是通过NRP-1与c-MET的结合实现在VEGF165上调MCL-1 表达。此外NRP-1能够强化人胶质瘤、胰腺癌中c-MET 活化[14，15]；而这种VEGF165-NRP-1-c-MET信号传导在前列腺癌的MCL-1 上调中也发挥重要作用[16]。Lu等[4]报道显示应用siRNA沉默NRP-1能显著降低AML细胞的增殖和迁移能力。这些研究结果提示NRP-1通过介导不同生长因子的信号转导，在肿瘤的发生发展过程中发挥复杂多样的作用。而NRP-1 在外周NK/T细胞淋巴瘤(Peripheral NK/T-cell lymphoma,PTCL)发生和发展中的作用机制尚待深究。

本研究前期实验，构建靶向NRP-1基因的干扰质粒，以慢病毒为载体，将NRP-1/shRNA整合到Jurkat 细胞中，沉默NRP-1基因，下调NRP-1 蛋白表达。而本实验结果显示，RNAi沉默NRP-1基因可抑制Jurkat细胞增殖，促进其凋亡，提高化疗药物敏感性；并可将细胞周期阻滞在G0/G1期，能增强EPI的抗肿瘤作用，其机制可能涉及Bcl-2/Bax途径的调节。为后续研究NRP-1在PTCL发生发展中的作用提供有效的实验模型，也为寻找PTCL有效治疗靶点方面提供新思路。NRP-1可能成为淋巴瘤分子治疗的靶点。

参考文献：

[1]Russo TA，Johnson JR.Proposal for a new inclusive designation for extraintestinal pathogenic isolates of Escherichia coli：ExPEC[J].Infect Dis，2000，181(5)：1753-1754.

[2]Benja min B,Gregory D,Steven G,etal.A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours[J].Nature,2011,478:399-403.

[3]Younana S,Elhoseinyb S,Hammamb A,etal.Role of Neuropilin-1 and its expression in Egyptian Acute Myeloid and Acute Lymphoid Leukemia patients[J].Leukemia Res,2012,36:169-173.

[4]Lu L,Zhang L,Xiao ZJ,etal.Neuropilin-1 in acute myeloid leukemia :Expression and role in proliferation and migration of leukemia cells[J].Leukemia and Lymphoma,2008,49(2):331-338.

[5]Meyerson HJ,Blidaru G,Edinger A,etal.NRP-1/CD304 Expression in Acute Leukemia[J].Hematopathology,2012,137:39-50.

[6]Grandelement C,Borg C.Neuropilins：A new target for cancer therapy[J].Cancers,2011,3:1899-1928.

[7]Gupta K，Hooton TM，Stamm WE. Increasing antimicrobial resistance and the management of uncomplicated community-acquired urinary tract infections[J].Ann Intern Med，2001，135(1)：41-50.

[8]Bekal S，Brousseau R，Masson L，etal. Rapid identification of Escherichia coli pathotypes by virulence gene detection with DNA microarrays[J].Clin Microbiol，2003，41(5)：2113-2125.

[9]Bauer RJ，Zhang L，Foxman B，etal. Molecular epidemiology of 3 putative virulence genes for Escherichia coli urinary tract infection-usp，iha，and iroN (E. coli)[J].Infect Dis，2002，185 (10)：1521-1524.

[10]Fantin A,Vieira JE,Plein A,etal.NRP-1 acts cell autonomously in endothelium to promote tip cell function during sprouting angiogenesis[J].Blood,2013,121(12):2352-2362.

[11]Russo TA，Carlino UB，Mong A，etal. Identification of genes in an extraintestinal isolate of Escherichia coli with increased expression after exposure to human urine [J].Infect Immun，1999，67 (10)：5306-5314.

[12]Li XY,Tang T,Zhou HG,etal.RNA interference targeting NRP-1 inhibits human glioma cell proliferation and enhances cell apoptosis[J].Mol Med Reports,2011,4:1261-1266.

[13]Bachelder RE，Crago A，Chung J，etal. Vascular endothelial growth factor is an autoc rine survival factor for neuropilin-expressing breast carcinoma cells[J].Cancer Res，2001，61(15)：5736-5740.

[14]Matsushita A,Gotzq T,Korc M.Hepatocyte growth actor-mediated cell in pancreatic cancer cells is dependent on neuropilin-1[J].Cancer Res,2007,67:10309-10316.

[15]Hu B,Guo P,Bar-Joseph I,etal.Neuropilin-1 promotes human glioma progression through potentiating the activity of the HGF/SF autocrine pathway[J].Oncogene,2007,26:5577-5586.

[16]Zhang S,Zhau H,Osunkoya AO,etal.Vascular endothelial growth factor regulates myeloid cell leukemia-1 expression through neuropilin-1-dependent activation of c-MET signaling in human prostate cancer cells[J].Mol Cancer,2010,9(9):9-24.

[收稿2015-05-07修回2015-06-15]

(编辑张晓舟)