糖尿病和糖尿病足溃疡患者淋巴管内皮祖细胞改变及其影响因素研究

糖尿病和糖尿病足溃疡患者淋巴管内皮祖细胞改变及其影响因素研究

魏民，陈存举，冯进，高玲

(中国人民武装警察8730部队医院，广东 广州 510800)

摘要：目的 探讨糖尿病患者和糖尿病足溃疡患者外周血淋巴管内皮祖细胞的改变及其影响因素。 方法 采用RT-PCR检测外周血白细胞中淋巴管内皮祖细胞标志物VEGFR3mRNA表达；采用免疫组织化学检测外周血白细胞VEGFR3蛋白表达，并计数VEGFR3阳性细胞数量；检测各组患者临床指标，分别和外周血VEGFR3表达进行统计学相关分析。 结果 与正常对照组比较，实验组外周血VEGFR3mRNA表达及VEGFR3蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.01)。糖尿病1组(HbA1C<7%)与正常对照组比较，VEGFR3阳性细胞数量减少，差异有统计学意义(P<0.05)；糖尿病2组(HbA1C≥7%)和糖尿病足组与正常对照组比较，VEGFR3阳性细胞数量减少(P<0.01)。相关因素分析显示： VEGFR3表达的影响因素为糖化血红蛋白、空腹血糖、收缩压、舒张压。结论 糖尿病及糖尿病足溃疡患者外周血淋巴管内皮祖细胞标志物VEGFR3表达减少，且和糖化血红蛋白、空腹血糖、收缩压、舒张压呈负相关。

关键词：糖尿病；糖尿病足；淋巴管内皮祖细胞

中图分类号：R587.1

文献标识码：A

文章编号：2095-4646(2015)04-0287-03

ABSTRACT：Objective To explore changs of lymphatic endothelial progenitor cells and its affecting factorsin peripheral blood leukocytes of diabetes patients and diabetic foot ulcer patients. Methods The gene expression of VEGFR3 was detected by RT-PCR，the protein expression of VEGFR3 was determined by immunohistochemistry，and the correlative factors were analyzed by statistical methods.Results Compared with normal control group，the gene and protein expression of VEGFR3 in diabetes group and in diabetic foot ulcer group were significantly decreased(P<0.01).Number of positive cells of VEGFR3 in peripheral blood of diabetes group and diabetic foot ulcer group was decreased than that of normal control group(P<0.01).The correlative analysis showed that factors decreasing VEGFR3 expression included HbA1C，systolic pressure，fasting blood-glucose and diastolic pressure.Conclusion The expression of VEGFR3 is decreased in peripheral blood of diabetes patients and diabetic foot ulcer patients，and there has negative correlation between VEGFR3 expression and HbA1C，systolic pressure，fasting blood-glucose and diastolic pressure.

收稿日期：(2015-05-13)

Changs of Lymphatic Endothelial Progenitor Cells and its Affecting

Factorsin Diabetes and Diabetic Foot Patients

WEI Min，CHEN Cun-ju，FENG Jin，et al

(DepartmentofInternalMedicine，8730ArmyHospitalofCAPF，GuangzhouGuangdong510515，China)

KEY WORDS：Diabetes;Diabetic foot;Lymphatic endothelial progenitor cell

糖尿病足溃疡是糖尿病的慢性并发症之一，难愈合的溃疡可能最终导致截肢，严重影响患者的生存和生活质量。尽管2型糖尿病患者足部溃疡皮肤神经、血管病变显著，但是溃疡并不延迟愈合[1]，推测尚有其他因素参与溃疡的修复。我们以往的研究发现：在糖尿病足溃疡组织中淋巴管内皮细胞标志物VEGFR3和 LYVE-1表达减少，可能与溃疡局部皮肤组织中淋巴管内皮重建不足，并且和溃疡难愈合相关[2，3]。为进一步探讨溃疡皮肤淋巴管数量减少的原因，本研究以糖尿病患者和糖尿病足溃疡患者外周血白细胞为研究对象，以期探讨在糖尿病患者和糖尿病足溃疡患者外周血淋巴管内皮祖细胞标志VEGFR3表达、淋巴管内皮祖细胞数量的改变以及其影响因素。

1资料与方法

1.1一般资料收集我院住院部符合纳入标准的糖尿病足溃疡患者以及同时期住院的糖尿病患者作为研究对象，正常对照采用同时期门诊知情同意的健康体检者。纳入标准：足部创面形成大于1个月，内科治疗无愈合倾向[2，3]。排除标准：恶性溃疡创面、特异性感染创面(结核、真菌及破伤风创面)；严重的心、肝、肾功能不全者；使用糖皮质激素治疗者；踝肱比≤0.9，跨皮氧分压<30mmHg。研究对象分为4组，分别为：糖尿病足溃疡组(diabetic foot，DF组)10例，男5例，女5例；年龄(52.30±4.66)岁；糖尿病病程(5.94±1.44)年；糖尿病足溃疡出现时间(64.00±10.38)d，平均溃疡面积0.8cm×1.7cm。糖尿病1组，(HbA1C<7%，DM1组)10例，男6例，女4例；年龄(54.14±5.65)岁；糖尿病病程(5.80±1.62)年。糖尿病2组(HbA1C≥7%，DM2组)10例，男5例，女5例；年龄(54.22±6.38)岁；糖尿病病程为(6.10±1.73)年。以上患者糖尿病符合1999年WHO诊断标准，均为2型糖尿病患者。正常对照组(NC组)10例，男7例，女3例；年龄(57.32±4.46)岁，为同时期门诊知情同意的健康体检者。

1.2检测方法采用RT-PCR检测各组患者外周血白细胞中淋巴管内皮细胞标志物VEGFR3mRNA的表达。取各组标本按照RT-PCR试剂盒说明书方法进行总RNA提取和逆转录实验，凝胶分析系统分析结果。VEGFR3引物序列：上游TGTTGGAGGTTAAGGCATACG；下游CGGGCTCTAAAGGGAAGAA；扩增长度为526bp。内参引物序列：上游AGCGAGCATCCCCCAAAGTT；下游GGGCACGAAGGCTCATCATT，长度为285 bp(上海英骏公司合成)。

采用免疫荧光化学法检测各组研究对象的VEGFR3蛋白表达以及VEGFR3阳性细胞的数量。取各组研究对象1ml，调整细胞浓度为2.0×106/ml，分别取0.2ml制作成细胞贴片，每例研究标本做成5张细胞贴片，参照免疫组织化学试剂盒说明书进行操作和染色。采用MIAS2000高清晰度病理图文报告系统分析各组VEGFR3阳性细胞蛋白表达及VEGFR3阳性细胞数量(每例标本随机取5个视野计数阳性细胞数量)。

收集各组实验对象的临床指标，与外周血白细胞VEGFR3表达做相关性统计学分析。

1.3统计学方法采用SPSS 13.0统计软件进行数据统计，数据采用均数±标准差表示，各组之间VEGFR3mRNA比较采用非参数检验，其余多组之间比较采用one-way ANOVA方法，方差不齐则采用多组间非参数检验，组间比较采用SNK比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1RT-PCR结果VEGFR3mRNA在各组中均有表达，因为各组VEGFR3mRNA表达数值方差不齐，故采用非参数检验，四组比较VEGFR3mRNA表达差异有统计学意义，见表1。

表1　各组外周血白细胞中VEGFR3mRNA表达的比较( ± s)

表1　各组外周血白细胞中VEGFR3mRNA表达的比较( ± s)

分组例数VEGFR3mRNAMeanRankNCDM1DM2DF101010101.292±0.0371.037±0.0670.634±0.073*0.5880±0.009*35.5025.5012.508.50

与NC组比较，*P<0.01

2.2VEGFR3蛋白表达结果VEGFR3蛋白在各组中均有表达。在显微镜下，每张载玻片分别选取5个视野，使用MIAS-2000高清晰度计算机病理图文报告系统，以每例标本表达量最强的 5个高倍视野(×400)的积分光密度值作为该例的测定值。DM2、DF和NC组比较，VEGFR3蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2　各组VEGFR3荧光强度积分光密度值比较( ± s)

表2　各组VEGFR3荧光强度积分光密度值比较( ± s)

分组例数积分光密度值NCDM1DM2DF10101010169.900±7.795111.600±5.66186.400±7.168*82.200±8.626*

与NC组比较，*P<0.01

2.3VEGFR3阳性细胞数量比较结果在显微镜下，每张载玻片分别选取5个视野，计数每个视野中的阳性细胞数量，以上结果由2个人完成，取2人结果的平均值。从细胞计数结果分析：DM1组与NC组比较，VEGFR3阳性细胞数量减少(P<0.05)；DM2组和DF组与正常对照组比较，VEGFR3阳性细胞数量显著减少(P<0.01)，见表3。

表3　各组VEGFR3阳性细胞数量的比较( ± s)

表3　各组VEGFR3阳性细胞数量的比较( ± s)

分组例数细胞数量(个)NCDM1DM2DF1010101037.24±6.0232.06±4.55*17.04±2.25**20.50±2.52**

与NC组比较，*P<0.05、**P<0.01

2.4外周血白细胞VEGFR3表达的相关临床因素分析相关因素分析结果：外周血白细胞VEGFR3表达的相关影响因素为空腹血糖(Spearman's r=-0.518，P=0.003)；收缩压(Spearman's r=-0.551，P=0.002);舒张压(Spearman's r=-0.391，P=0.033)；糖化血红蛋白(Spearman's r=-0.625，P=0.000)；与甘油三酯、胆固醇、空腹C肽，餐后2hC肽无相关性，见表4。

表4　VEGFR3表达和临床指标相关性分析(n=10， ± s)

表4　VEGFR3表达和临床指标相关性分析(n=10， ± s)

项目DM1DM2DF相关系数P空腹血糖(mmol/L)8.85±2.3213.88±6.8410.93±2.68-0.520.00甘油三酯(mmol/L)1.21±0.663.19±5.921.57±0.91-0.180.34胆固醇(mmol/L)3.72±1.356.37±4.843.90±1.07-0.220.24收缩压(mmHg)119.80±7.32129.70±29.08139.50±22.45-0.550.00舒张压(mmHg)71.50±8.2977.40±15.0377.40±7.40-0.390.03糖化血红蛋白(%)6.59±0.2611.40±2.238.92±1.96-0.630.00空腹C肽(ng/L)1.69±1.361.26±0.971.18±0.840.060.75餐后2hC肽(ng/L)3.50±2.352.36±2.232.22±2.070.180.35

3讨论

有研究发现，淋巴管内皮细胞除了参与胚胎正常淋巴管发育[4]、肿瘤转移等过程外，还参与组织修复、炎症反应[5]等过程。在创面组织修复过程中，无论是炎症急性反应阶段，还是慢性反应阶段，淋巴管的形成都发挥了重要的作用[6]。VEGFR3是淋巴管内皮细胞的标志物，也是淋巴管内皮祖细胞的标志物。

本研究以糖尿病患者和糖尿病足非缺血性溃疡患者外周血白细胞为研究对象，分别检测各组外周血白细胞中的VEGFR3表达以及VEGFR3阳性细胞的数量，并将VEGFR3表达和临床指标进行了相关性分析，进一步探讨糖尿病足溃疡患者和糖尿病患者外周血中VEGFR3表达的影响因素。RT-PCR结果显示：各组细胞均有VEGFR3mRNA表达。通过非参数检验的Mean Rank分析：NC组和DM1组的VEGFR3mRNA表达高于DF组和DM2组(P<0.01)。表明外周血白细胞中VEGFR3mRNA表达减少对于DF组和DM2组更有意义。细胞免疫荧光化学的结果显示：计数5个高倍视野中的积分光密度值，结果为DM2组、DF组与NC组比较，VEGFR3蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.01)，DM1组和NC组比较无统计学差异。在相同细胞浓度和相同视野的细胞涂片中，我们计数了每组计数10个标本，每张标本分别计数了镜下5个视野，NC组的VEGFR3阳性细胞数量最多，DM1组其次，DF组和DM2组最少。VEGFR3表达量的相关因素分析结果表明：空腹血糖、收缩压、舒张压和糖化血红蛋白与VEGFR3表达呈负相关，与甘油三酯、胆固醇、空腹C肽，餐后2hC肽无显著相关性。我们的研究证实空腹血糖升高和糖化血红蛋白与外周血中VEGFR3阳性细胞数量减少有关。在以往的研究中已经证实[7]：糖尿病患者外周血中血管内皮祖细胞减少，可能与氧化应激、血红素加氧酶表达以及脂联素有关。而高血压导致外周血管内皮祖细胞减少的原因可能为：氧化应激和炎症等[8]。但是高血糖、高血压导致淋巴管内皮祖细胞减少的具体原因有待今后的研究继续探讨。

综上所述，我们推测糖尿病患者在血糖控制欠佳或者合并高血压的情况下，骨髓淋巴管内皮祖细胞释放减少，导致了外周血中的淋巴管内皮祖细胞数量减少。如果此时合并足部溃疡，则在溃疡局部不能形成足够的淋巴管，从而影响了局部创面的炎症反应，延长了创面的愈合时间。所以，糖尿病患者淋巴管内皮祖细胞数量减少是糖尿病足溃疡皮肤淋巴管内皮形成障碍的原因之一。

参考文献：

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