Plackett－Burman设计和响应面法优化芥子中硫苷的超声波提取工艺

黄文红 冯玉红 李嘉诚 颜慧琼高鹏博 王春修 张永利 王荔宁

Plackett－Burman设计和响应面法优化芥子中硫苷的超声波提取工艺

黄文红1冯玉红1李嘉诚1颜慧琼2高鹏博1王春修1张永利1王荔宁1

（海南大学材料与化工学院1，海口 570228）
（海南师范大学化学与化工学院2，海口 571100）

通过预试验和扫描电镜法分析得出超声波提取可提高芥子中硫苷的提取率，进而采用Plackett－Burman（PB）试验和响应面法研究芥子中硫苷的超声波提取最佳工艺条件，并以硫苷的提取率作为响应值。在单因素试验的基础上，采用PB试验从影响超声波提取的因素中筛选出超声功率和乙醇浓度两个显著因素，在此基础上，通过最陡爬坡试验逼近最大硫苷提取率区域，然后通过中心组合设计试验对显著因素进行优化，得出最佳超声波提取工艺条件为：仪器（超声波细胞粉碎机）参数为超声功率300 W、超声工作时间4 s（间歇时间6 s），提取总时间25 min（即超声150次），液料比15∶1（mL／g）和乙醇体积分数48%。在此条件下，硫苷提取率为2.902%，与预测值2.894%相对误差为0.276%。这表明PB试验结合响应面法可以很好地优化芥子中硫苷的超声波提取工艺。

芥子 硫苷 超声波提取 响应面法

芥子是十字花科芸薹属植物芥的干燥成熟种子［1］，其含有丰富的营养物质，如芥子苷、芥子碱、蛋白质和脂肪油等［2］。芥子苷也称硫代葡萄糖苷，简称硫苷，芥子的主要功效组分之一，是广泛存在于十字花科植物中的一类含硫次生代谢产物［3］。

此前研究主要集中在十字花科植物中硫苷的提取分离［4］，如江敏等［5］采用沸甲醇－ 水溶液（70∶30，V／V）从西兰花籽中提取硫苷，经阴离子交换柱、液相制备色谱分离纯化后，进行结构鉴定；Wang等［6］采用乙醇浸提法从印度芥子中提取硫苷，并利用响应面法中BBD试验设计对乙醇浸提工艺进行优化，得出最佳工艺条件。硫苷虽没有直接的生理活性，但其在适当的条件下可降解成一系列的具有生理活性的降解产物，如抗癌活性显著的异硫氰酸酯［7］。同时，硫苷的某些降解产物也会对机体产生毒副作用，如甲状腺素生长不足和肾中毒等［8］。基于硫苷降解的利弊方面，本试验拟对芥子中硫苷的提取条件进行优化，以期得到芥子中硫苷的最佳提取条件，为硫苷的可控降解过程研究提供参考。

超声波提取方法由于操作过程简单快捷、温度低、提取率高、提取物的结构不易破坏等特点，已被广泛应用于天然产物中有效成分的提取［9－10］。但对芥子中硫苷的超声波提取工艺的优化研究鲜见报道。本试验首先根据预试验中乙醇浸提后和超声波提取后原料的扫描电镜分析结果，发现超声波对芥子的细胞壁破坏显著，从而使芥子中硫苷的溶出阻力减小，可大大提高提取率［11］。而芥子中硫苷的超声波提取受到多种因素的影响，并且各因素之间存在交互影响，必须经过大量试验探索提取工艺。因此，超声波提取工艺中各因素对硫苷提取率的影响及其交互作用是值得深入研究的。

Plackett－Burman（PB）设计法是一种经济而有效的试验设计方法，可以通过较少的试验次数，从众多的影响因素中筛选出主要的影响因素［12－13］。而响应面法是可以评价各因素及其交互作用，从而优化工艺参数的目的的一种试验方法［14］。本研究采用Plackett－Burman（PB）设计法筛选出主要影响因素、并利用中心组合（Central Composite）设计法对筛选出的主要影响因素进一步优化，以期获得芥子中硫苷的最佳超声波提取条件，为芥子中硫苷的进一步应用提供参考。

1 试验

1.1 材料、试剂与仪器

芥子：海南省种子公司；烯丙基硫苷（纯度≥98%）：美国Sigma公司；乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）：美国Fisher公司；RV10旋转蒸发仪：德国IKA公司；Universal 32R高速离心机：德国Hehith公司；Scientz－ⅡE超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；2695高效液相色谱仪：美国Waters公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理

芥子100℃烘干2 h，以达到充分灭活酶的目的。灭酶后原料用粉碎机充分粉碎，脱脂，干燥后备用。

1.2.2 硫苷的提取

称取2 g芥子粉末，按照一定的液料比加入乙醇溶液，超声波提取一定时间后离心，沉淀物重复提取1次，合并上清液，旋蒸至少量（约10 mL），取其中1 mL稀释，过0.22μm滤膜，HPLC检测。

1.2.3 预试验

称取2 g脱脂处理后的芥子粉末，分别采用溶剂浸提法和超声波提取法，测定其提取率。同时，对溶剂提取后和超声处理后的原料进行扫描电镜（SEM）分析，观察其细胞壁破坏的微观形貌。

1.2.4 单因素试验

在影响芥子中硫苷超声波提取的众多因素中，选取提取温度、提取时间、液料比、超声时间、超声波频率5个主要因素进行探讨，以芥子中硫苷提取率为考察目标，研究各因素对其的影响。

1.2.5 PB试验设计法

PB试验设计广泛地用于因素主效应的估计。根据单因素试验的结果，确定PB试验设计的因素和水平，对影响硫苷提取的5个因素——超声功率、超声时间、液料比、提取时间、乙醇浓度进行考察，每个因素取高（1）、低（－1）2个水平，以硫苷得率为响应值，选用N＝7的P B设计，其中2个空白作为误差分析项，采用试验次数为12的试验设计。

表1 Plackett－Burman试验设计因素及编码值

1.2.6 最陡爬坡试验设计

根据PB试验结果，确定影响显著的因素，并根据其影响效果，确定爬坡方向，选择合理步长，从而逼近提取率最高的区域。最陡爬坡试验的目的在于选出最佳提取率范围作为响应面试验因素水平的中心点进行响应面试验设计［15］。

1.2.7 中心组合试验设计

综合PB试验结果和最陡爬坡试验结果，采用中心组合试验设计（Central Composite Design，CCD）对影响硫苷提取率的显著因素作进一步的探讨，对芥子中硫苷的超声波提取工艺进行优化，以获得最佳提取工艺。

1.3 硫苷的测定方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：XBridge C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.05%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）；浓度梯度：0～20 min，A∶B ＝99∶1，20 min，A∶B ＝40∶60，21 ～30 min，A∶B ＝99∶1；流速1mL／min，柱温30 ℃，进样量为10μL，检测波长240 nm。

1.3.2 标准曲线的绘制

称取0.019 9 g烯丙基硫苷（M r＝398.47）溶解定容成50 mL溶液，制得1 mmol／L的标准溶液。逐步稀释成浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40 mmol／L的标准溶液。浓度由低到高依次进样，分别进样2次，每次10μL。以峰面积为纵坐标（y，mAU·s），浓度为横坐标（x，mmol／L），进行线性回归，得到回归方程y＝127.66x－104.12，R2＝0.998 9。

1.3.3 硫苷提取率的计算

烯丙基硫苷提取率采用内标法计算：

2 结果与分析

2.1 预试验结果分析

在溶剂浸提条件（料液比1∶25，提取时间2 h，乙醇体积分数50%，提取温度50℃）下，硫苷提取率为0.046 5%，而在超声波辅助溶剂浸提下的硫苷提取率可达2.037 1%，可见超声波提取可大大提高硫苷的提取率。

为了探讨超声波提取使提取率升高的原因，分别对脱脂后、溶剂浸提和超声波提取后的原料进行了扫描电镜分析，结果如图1所示。由图1a可知，脱脂后芥子的细胞壁仍被一层厚厚的组织覆盖，这可能是提取的主要障碍；图1b中，经过乙醇浸提后，细胞表面的组织结构仍然存在，但明显变薄，初步可见细胞壁结构；图1c中，覆盖在细胞壁上的组织结构被消除，说明超声波作用使得细胞内硫苷的溶出阻碍降低，进而是硫苷提取率升高。通常固体粉末的浸提包括2个过程：首先是溶剂的浸泡作用，使得原料的细胞组织肿胀和水化；然后是在溶剂的渗透与扩散作用下，原料中有效成分的传质作用［15］。超声波提取能够使植物细胞壁随着超声波的高速震动和空穴破碎作用受到破坏，使溶剂渗透到细胞中，令其中的化学成分溶于溶剂中，从而提高提取率［16］。

图1 不同处理方式下材料的扫描电镜图

2.2 超声波提取过程的单因素试验

2.2.1 超声功率对硫苷提取率的影响

在料液比15∶1（mL∶g）、乙醇体积分数70%、超声时间3 s（间歇时间5 s）和提取总时间10 min的条件下，考察不同超声功率对硫苷提取率的影响，结果见图2。随着超声功率的增加，硫苷提取率不断增加，在300 W时达到最高，继续升高超声功率提取率又开始下降。这主要是因为硫苷这种代谢产物存在于植物细胞中［16］，超声功率的增大可以有效破坏芥子的细胞壁结构，使硫苷类物质得以溶出。然而，过高的超声功率不仅破坏了细胞壁，还造成了其他水溶性杂质的溶出［16］，另外过高的功率能耗也较大。综合考虑超声功率选择300 W较为适宜。

2.2.2 提取总时间对硫苷提取率的影响

在液料比15∶1、乙醇体积分数70%、超声功率300 W、超声时间3 s（间歇时间5 s）的条件下，考察不同提取总时间对硫苷提取率的影响，结果如图2所示。提取时间一般越长提取效果越好，但过长的提取时间反而会使提取率下降。在提取时间为20 min时硫苷提取率最大，因此提取时间确定为20 min。

2.2.3 液料比对硫苷提取率的影响

在超声时间3 s（间歇时间5 s）、提取总时间10 min、乙醇浓度70%、超声功率300 W的条件下，考察不同液料比对硫苷提取率的影响，结果如图2所示。随着液料比的增大，硫苷的提取率呈现先升高后下降的趋势。通常情况下，增大液料比有助于有效成分的溶出，但液料比过大对提高硫苷提取率没有显著效果，反而会加大提取的成本。超声波提取硫苷的适宜液料比为20∶1。

2.2.4 乙醇浓度对硫苷提取率的影响

在超声时间3 s（间歇时间5 s）、提取总时间10 min、料液比15∶1、超声功率300 W的条件下，考察不同乙醇浓度对硫苷提取率的影响，结果如图2所示。随着乙醇浓度的提高，硫苷提取率升高，在乙醇体积分数50%时，提取率最高，这是由于提高乙醇浓度可增加溶剂对物料的渗透力。但是乙醇浓度过高（≥70%）不足以破坏芥子中硫苷与其他物质的连接，而水的比例太大又会促进其他水溶性杂质的溶出，故选择50%乙醇提取为佳。

2.2.5 超声时间对硫苷提取率的影响

在料液比15∶1、乙醇体积分数70%、提取总时间10 min、超声功率300 W的条件下，考察不同超声时间对硫苷提取率的影响，结果见图2。当超声时间在2～6s时，提取率稍有下降；随着超声时间的继续延长，硫苷提取率明显降低。这可能是由于超声时间增加，温度升高，在温度和超声波的联合作用下，破坏了硫苷的原有结构。而超声时间越短，超声频率越高，需要的能量也越大。故超声时间选4 s为佳。

图2 不同条件对硫苷提取率的影响

2.3 PB试验设计筛选影响超声提取效果的显著影响因素

在单因素试验的基础上，确定Plackett Burman（PB）试验设计的因素与水平，PB试验设计及响应值见表2。运用Design－expert 7.0软件对各个因素进行分析，选出显著因素进行进一步分析。由表3可知，对硫苷提取率有显著影响的因素有超声功率和乙醇浓度（P＜0.05），且都有正效应。因此，选取超声功率和乙醇浓度2个参数作为进一步考察对象。另外，影响不显著的因素中，提取时间有正效应，超声时间、液料比有负效应。

表2 Plackett Burman试验设计及响应值

表3 PB试验参数估计表

2.4 最陡爬坡试验

由表3可以确定最陡爬坡方向，超声功率和乙醇浓度对硫苷提取率影响最为显著，且系数都为正，说明适当加大超声功率和提高乙醇浓度有利于硫苷提取。采取2个因素同时变化进行最优化搜索，通过设计合理步长，逼近提取率最高的区域。由表4可知，最大硫苷提取率出现在第2次试验E2附近。

表4 最陡爬坡试验设计及结果

2.5 中心组合设计

响应面拟合方程在考察的紧接邻域里才近似真实情形，因此，要先逼近最大提取率区域后才能建立有效的响应面拟合方程。故以爬坡试验中的第2次试验条件作为响应面试验因素水平的中心点，在超声时间4 s（对应间歇时间6 s）、提取总时间25 min和液料比15∶1的条件下，进行响应面试验设计。二因素五水平的响应面中心组合试验分析结果见表5～表6。

表5 中心组合试验设计及结果

表6 回归分析结果

2.6 显著因素水平的优化

由Design－Expert 7.0软件拟合得到的方程为：R1＝2.65＋0.37A＋0.098B－0.32AB－0.15A2－0.46B2。回归方程中各变量对响应值影响的显著性，由F检验来判定。从表6可以看出，各因素中，一次项A、交互项AB、二次项B2都影响显著。而模型的校正决定系数为0.897 2，说明该模型能解释约89.7%响应值的变化；决定系数R2＝0.940 0，说明该模型拟合程度较好，因此可用上述模型代替真实试验点对芥子中硫苷的超声波提取工艺进行分析和预测。

同时，运用Design－Expert 7.0软件对回归方程进行分析，可求得该方程的最大值及对应的因素水平A＝1.000、B＝ －0.242，即超声功率300 W、乙醇体积分数47.58%。考虑到实际操作，乙醇体积分数取48%。优化后的水解工艺参数为超声功率300 W、超声时间4 s（对应间歇时间6 s）、提取总时间25 min、液料比15∶1和乙醇体积分数48%，最大提取率为2.902%。而实际硫苷提取率为2.894%，与预测值比较接近，能很好地预测结果。

3 结论

3.1 通过超声波辅助溶剂浸提预试验，发现超声波能够促进芥子细胞壁的破坏，有利于提高硫苷提取率。

3.2 对影响超声波提取芥子中硫苷的超声功率、提取时间、液料比、乙醇浓度、超声时间5个因素分别进行了单因素考察，并采用PB试验设计、最陡爬坡试验、中心组合设计筛选出对硫苷提取率有显著影响的2个因素——超声功率和乙醇浓度，建立了回归方程R1＝2.65＋0.37A＋0.098B－0.32AB－0.15A2－0.46B2，拟合程度良好，可用于实际预测。

3.3 在超声时间4 s（对应间歇时间6 s）、提取总时间25 min和液料比15∶1的条件下，通过响应面法优化超声波提取硫苷的最佳工艺条件为：超声功率300 W、乙醇体积分数48%。在此工艺下，硫苷提取率为2.894%，高于常规溶剂提取率，且超声波提取具有简单省时高效的优势。

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Optimization of Ultrasound Extraction of Sinigrin from Mustard Seed by Plackett－Burman Design and Response Surface Methodology

Huang Wenhong1Feng Yuhong1Li Jiacheng1Yan Huiqiong2Gao Pengbo1Wang Chunxiu1Zhang Yongli1Wang Lining1
（College of Materials and Chemical Engineering，Hainan University1，Haikou 570228）
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University2，Haikou 571100）

The conclusion that the yield of sinigrin can be improved under ultrasound extraction was obtained with the pre－test and scanning electron microscopy analysis，and then the optimal ultrasound extraction conditions of sinigrin from mustard seed were studied.On the basis of single factor tests，ultrasound power and ethanol concentration were identified by Plackett－Burman（PB）design as main factors that influence ultrasound extraction.And the optimal regions were approached by the steepest ascent design.Then using central composite design and response surface analysis，the optimal ultrasound extraction conditions were as follows：the instrument parameters：ultrasound power 300 W，ultrasound time 4 s （interval time 6 s），total extraction time 25 min，ratio of liquid to solid 15∶1（mg／L），ethanol concentration 48%.Under this optimum condition，the yield was 2.902%，which was very close to 2.894%of prediction value.The result shows that the ultrasound extraction conditions of sinigrin from mustard seed can be well optimized by PB design combined response surface methodology.

mustard seed，sinigrin，ultrasound extraction，response surface methodology

TS20

A

1003－0174（2016）07－0076－06

国家科技支撑计划（2011BAE06B04－07），海南省重点科技计划（ZDXM20120003），海口市重点科技计划项目（2014055），海南省自然科学基金（213010），海南省自然科学基金（20152020）

2014－11－02

黄文红，女，1990年出生，硕士，化学工程

冯玉红，女，1969年出生，教授，纤维素改性及生物材料