高效液相色谱法测定玉米蛋白粉中游离氨基酸含量

刘跃芹 吴延东 赵雪松 刘艳波 吴 杰 闫 寒

高效液相色谱法测定玉米蛋白粉中游离氨基酸含量

刘跃芹 吴延东 赵雪松 刘艳波 吴 杰 闫 寒

（玉米深加工国家工程研究中心，长春 130033）

建立高效液相色谱法同时测定玉米蛋白粉中17种游离氨基酸含量的方法。样品用盐酸溶液（0.1 mol／L）提取，采用6－氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚胺基－氨基甲酸酯（AQC）为衍生剂衍生。应用Nova－PakTM C18柱，以10 mmol／L醋酸铵缓冲液、乙腈和超纯水为流动相进行梯度洗脱，柱温为37℃，检测波长为248 nm，外标法定量。结果表明，17种游离氨基酸线性关系良好，其中16种游离氨基酸在0.002 5～0.5 μmol／mL范围内具有良好的线性关系，胱氨酸浓度在0.006 3～1.25μmol／mL范围内线性关系良好，相关系数在0.999 1～0.999 9之间，回收率为95.10% ～105.21%，RSD为1.36% ～4.39%。该方法灵敏度高、重现性好、操作简单，可用于检测玉米蛋白粉中游离氨基酸含量。

高效液相色谱法 游离氨基酸 玉米蛋白粉

玉米蛋白粉已被广泛应用于鸡、猪和牛的养殖生产，饲用价值高，安全性能好，潜在开发性大［1－4］。氨基酸是合成蛋白质，维持氮平衡，构成体内各种酶、抗体及某些激素的原料，并且能调节生理机能，促进生长发育，补充能量代谢消耗。对玉米蛋白粉中游离氨基酸的含量进行监控，有利于玉米蛋白粉的更广泛应用。

氨基酸测定最常用的分析方法有：氨基酸专用分析仪分析，高效液相色谱仪分析，高效液相色谱－质谱联用技术分析等［5］。但是氨基酸专用分析仪的价格昂贵，专属性强，仪器利用率低；高效液相色谱－质谱联用技术前处理繁琐；高效液相色谱法因其分离效率高、选择性好、灵敏度高、分析速度快和自动化程度强等优点，成为氨基酸分析的首选方法。氨基酸检测有柱前衍生和柱后衍生2种衍生方式，柱后衍生需要额外设备，使检测成本增加，并且分析时间长。6－氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚胺基－氨基甲酸酯（AQC）柱前衍生化法是近年来使用最广泛的氨基酸分析方法，具有简单、灵敏而快速的优点。AQC是一种具有高反应活性的杂环氨基甲酸酯，可与伯胺和仲胺反应生成稳定的衍生物脲，该衍生物较稳定且有很强的紫外吸收和荧光吸收，衍生操作简单快速，30 s即可反应完全［6－9］。故本试验以AQC为衍生试剂，采用柱前衍生化高效液相色谱法对玉米蛋白粉中17种游离氨基酸进行测定，建立了快速、准确的定量方法，对玉米蛋白粉能够更好地应用具有参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

17 种混合氨基酸标准液，含Asp、Ser、Glu、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Pro、Cys2、Tyr、Val、Met、Lys、Ile、Leu、Phe，浓度均为2.5 μmol／mL（除Cys2浓度为1.25 μmol／mL）；玉米蛋白粉：市售；2695 高效液相色谱仪、2414可变波长型紫外检测器、6－氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚胺基－氨基甲酸酯（AQC）：美国Waters公司；Milli－Q Gradient A10超纯水系统：美国Millipore公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准品溶液的配制

取1 mL氨基酸标准液，与4 mL超纯水混合，制成0.5μmol／mL的氨基酸储备液。精密量取储备液适量，超纯水稀释至所需浓度，浓度分别为0.002 5、0.008 3、0.025、0.083、0.25、0.5 μmol／mL，保存于4℃冰箱。

1.2.2 样品的提取

将玉米蛋白粉样品粉碎并过0.25 mm孔径（60目）筛，充分混匀后装入磨口瓶中备用。称取0.2～0.5 g试样，加0.1 mol／L盐酸提取剂30 mL，搅拌提取15 min，沉放片刻，将上清液过滤到100 mL容量瓶中，残渣加超纯水25 mL，搅拌3 min，重复提取2次，再将上清液过滤到上述容量瓶中，用超纯水冲洗提取瓶和滤纸上的残渣，并定容摇匀，过0.2μm滤膜。

1.2.3 样品的衍生

衍生反应是将标样和样品提取液中的氨基酸转化为稳定的AQC衍生物，移取10μL样液注入衍生管，加入70μL硼酸盐缓冲液到衍生管中，涡旋混合，加入20μL配好的衍生剂（AQC为10 mmol／L的乙腈溶液），涡旋混和10 s，在室温下放置1 min，在55℃烘箱内加热10 min，取出，待测。

1.2.4 标准曲线的绘制

将0.002 5、0.008 3、0.025、0.083、0.25 、0.5 μmol／mL的氨基酸标准品衍生后，进行HPLC析，记录色谱图；以待测物浓度为横坐标，待测物的峰面积为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算［10］，求得的直线回归方程，即为标准曲线。

1.2.5 准确度和精密度的考察

分别制备低、中、高3个浓度（0.008 3、0.083、0.25 μmol／mL）的质量控制（QC）样品，每浓度6 样本，衍生后，连续测定3 d。根据当日的工作曲线，计算QC样品的测得浓度，根据QC样品结果计算本法的准确度与精密度。

1.2.6 提取回收率的考察

准确称取已测定出游离氨基酸含量的玉米蛋白粉样品6份，分别按游离氨基酸质量分数的80%、100%和120%加入氨基酸标准液，然后按“1.2.2”和“1.2.3”操作，进行HPLC分析，获得相应峰面积，计算提取回收率。

1.2.7 样品中17种氨基酸的测定

按“1.2.2”和“1.2.3”制备3个平行样品，每个分析批（1 d内测试的同种样品）制备1条工作曲线，进行HPLC分析，根据峰面积进行定量计算。

1.2.8 色谱条件

色谱柱为Nova－PakTM C18柱（3.9 mm×150 mm，4 μm）；流动相：A 流动相为10 mmol／L 醋酸铵缓冲液（以冰醋酸调至pH 5.10），B相为乙腈，C相为超纯水；流速为1 mL／min，梯度洗脱见表1；柱温为37℃；检测波长为248 nm；进样体积为10μL；样品分析时间为50 min。

表1 梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 分析方法可靠性验证

测定17种氨基酸的典型标准曲线，线性范围在0.002 5～0.5μmol／mL之间具有良好的线性关系，胱氨酸浓度在0.006 3～1.25μmol／mL之间线性关系良好，相关系数在0.999 1～0.999 9之间。以信噪比S／N为3计算最低检出限。测得各氨基酸的回收率为95.10%～105.21%，相对标准偏差（RSD）为1.36%～4.39%。线性关系、检出限、回收率和精密度测定结果见表2，表明该方法准确度和精密度高，方法可靠。

表2 17种氨基酸的相关系数、检出限、回收率与精密度试验（n＝6）

2.2 样品测定结果

氨基酸标准品色谱图和样品色谱图见图1，17种氨基酸按出峰顺序分别是，天冬氨酸，丝氨酸，谷氨酸，甘氨酸，组氨酸，精氨酸，苏氨酸，丙氨酸，脯氨酸，胱氨酸，酪氨酸，缬氨酸，蛋氨酸，赖氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸。测得玉米蛋白粉中游离氨基酸的含量见表3，16种游离氨基酸含量范围为0.021 1～0.176 8 mg／g，其中亮氨酸含量最高，胱氨酸含量低于最低检出限，未被检出。玉米蛋白粉中16种游离氨基酸总量为0.968 9 mg／g。玉米蛋白粉中检出7种必需氨基酸，为苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸，占17种游离氨基酸总量的49.78%。

图1 17种混合氨基酸标准品和玉米蛋白粉样品的AQC衍生化溶液的HPLC图谱

表3 玉米蛋白粉中17种游离氨基酸的测定结果（mg／g湿基，n＝3）

3 结论

采用以AQC为衍生剂的柱前衍生法，使衍生操作简单快速，高效液相色谱仪配紫外检测器可以将样品中17种游离氨基酸的色谱峰与其他基质峰进行有效地分离，且峰形良好，可以对玉米蛋白粉中17种游离氨基酸进行精确定量。玉米蛋白粉样品前处理简单，氨基酸是两性物质，在弱酸溶液中稳定，本法采用0.1 mol／L的盐酸水溶液进行提取，前处理操作步骤少，经济快速，稳定可靠，适用于玉米蛋白粉中游离氨基酸的快速测定。

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Determination of Free Amino Acids by High Performance Liquid Chromatography in Corn Gluten Meal

Liu Yueqin Wu Yandong Zhao Xuesong Liu Yanbo Wu Jie Yan Han
（National Engineering Research Center of Corn Deep Processing ，Changchun 130033）

High performance liquid chromatography was to be established along with a method for the determination of 17 kinds of free amino acids in corn gluten meal by high performance liquid chromatography.The specimen was extracted with hydrochloric acid solution （0.1 mol／L），and 6 －ami－noquinolyl－N －hydroxysuccinimidyl carbamate（AQC）then was derivatized from the derivating agent.Gradient elution was achieved by using a Nova－Pak-TM C18，and ammonium acetate buffer solution（10 mmol／L），acetonitrile and deionized water as the mobile phase with the column temperature of 37℃，the detected wave length of 248 nm.The external standard method was used for quantification.Results show there was a good linear relationship for 17 free amino acids，of which a good linear relationship was identified in 16 free amino acids in the range of 0.002 5 ～0.5 μmol／mL，while cystine in the range of 0.006 3～1.25 μmol／ml.The correlation coefficient is in the range of 0.999 1 ～0.999 9.Average recovery of 17 amino acids was95.10%～105.21%，and the RSD was in the range of 1.36%～4.39%.This method is highly sensitive，reproducible ，simple and suitable for the determination of free amino acids in corn gluten meal.

HPLC，free amino acids，corn gluten meal

O657.7

A

1003－0174（2016）07－0153－04

农业科技成果转化资金（2012GB2B100101）

2014－12－03

刘跃芹，女，1986年出生，硕士，玉米深加工与食品安全