谷物霉菌挥发性物质的电子鼻与GC－MS检测研究

沈 飞 吴启芳 魏颖琪 都立辉 唐培安

谷物霉菌挥发性物质的电子鼻与GC－MS检测研究

沈 飞 吴启芳 魏颖琪 都立辉 唐培安

（南京财经大学食品科学与工程学院／江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心／江苏省高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，南京 210023）

为建立粮食受霉菌污染的快速检测方法，本研究利用电子鼻与气相色谱质谱联用（GC－MS）技术对6种谷物中常见霉菌在不同生长阶段（1、2、5、13 d）的特征挥发性气味物质进行了检测分析。GC－MS结果显示不同霉菌的挥发性物质成分存在差异，且在生长后期差异更加显著。基于电子鼻信号的主成分分析（PCA）法能够有效区分生长中后期（5、13 d）不同菌属的霉菌样品。线性判别分析（LDA）和偏最小二乘判别分析（PLS－DA）模型对黄曲霉类、寄生曲霉类和青霉类样品的整体判别正确率分别达到100%和97.4%。结果表明，运用电子鼻与GC－MS技术对粮食霉菌污染情况进行快速鉴定具有一定可行性。

粮食 霉菌污染 电子鼻 GC－MS 快速检测

粮食在储运过程中极易感染霉菌导致发霉变质［1］，不仅造成粮食损失，甚至还产生真菌毒素，严重威胁人畜健康［2－3］。目前，粮食霉菌感染的分析方法主要有：菌落计数法［4］、薄层色谱分析法［5］、高效液相色谱法［6－8］等，操作繁琐，成本高且时效性差，难以实现粮食品质的实时监控，因此，亟需发展一种快速、准确且经济可行的检测方法。粮食在霉变过程中，由于微生物不断分解粮食有机质，会产生大量特征挥发性物质。研究发现，这些挥发性成分与菌落总数、麦角甾醇以及真菌毒素等表征粮食霉变的指标之间存在内在联系［9－12］，可用于粮食霉菌污染程度的实时监测。Gobbi等［13］研究发现，玉米中伏马菌毒素含量高低与霉变玉米的气味物质紧密相关，可通过气味变化预测毒素含量。Pasanen等［14］在谷物上接种了产毒素和非产毒素菌株，发现毒素的产生与挥发性成分的组成比例有关。其中，萜烯类物质与单端孢霉烯族毒素存在相关关系，产赭曲霉毒素的青霉菌株所产生的酮类成分高于非产毒素的菌株。电子鼻作为一种新型气味识别技术，在谷物品质检测中应用越来越广泛［15］。尹芳缘等［16］利用电子鼻对燕麦霉变程度进行了成功的区分。Paolesse等［17］利用电子鼻和GC－MS对含水量不同的小麦的早期霉变进行了检测，结果均显示霉变样品的挥发性成分与正常样品存在显著差异。然而，目前的研究多侧重于粮食霉变状态的定性区分［18－19］，缺乏对霉菌自身特征气味成分的鉴别分析，难以实现粮食受何种霉菌感染情况的准确判定，无法有效指导开展针对性防控。

本研究利用电子鼻与GC－MS技术，对谷物中常见的6 种霉菌在不同生长阶段（1、2、5、13 d）的特征挥发性气味物质进行检测分析，并运用主成分分析（PCA）、线性判别分析（LDA）和偏最小二乘判别分析（PLS－DA）法建立不同菌属霉菌样品的判别模型，分析其挥发性物质成分的差异，探讨电子鼻技术用于粮食霉菌气味快速鉴定与早期预警的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

6种谷物中常见霉菌标准菌株：黄曲霉3.3950、黄曲霉3.17、寄生曲霉3.124、寄生曲霉3.395、岛青霉3.260和黄绿青霉3.99：中国北京北纳创联研究院，购买后置于4℃冷藏状态下保存，待活化接种。高盐察氏培养基：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验设备

Fox 3000型电子鼻：法国Alpha MOS公司；GC（7890A）－MS（5975C）气质联用分析仪：美国安捷伦公司；50 μm －PDMS／DVB／CAR 固相微萃取头：美国Supelco公司。

1.3 试验方法

初始阶段，6种霉菌均被接种在经115℃灭菌30 min后的高盐察氏培养基（蔗糖30.0 g；NaNO32.0 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；KCl 0.5 g；FeSO4·4H2O 0.01 g；K2HPO41.0 g；琼脂20.0 g；蒸馏水1 000 mL；pH 6.0～6.5）上进行培养，然后取5 mL灭菌去离子水于培养基表面，震荡2 min，吸取1 mL于培养皿中，加入5 mL灭菌后的培养基，轻轻振荡10 s，置于28℃培养箱中培养。

1.3.1 电子鼻检测步骤

分别对在培养基上生长周期分别为1、2、5和13 d的霉菌菌株进行电子鼻检测。将每个培养皿中的菌株及培养基全部转移至20 mL顶空瓶中，密封，进行电子鼻分析。采用顶空自动进样法，以零级发生器气体为载气，参数条件见表1。采用电子鼻自带软件对数据进行采集，得到每个样品所对应的12个传感器各自的响应信号，并提取每个传感器响应信号的特征值进行下一步分析。

表1 电子鼻与GC－MS仪器参数条件

1.3.2 GC－MS检测步骤

采用顶空固相微萃取GC－MS法（HS－SPMEGC －MS）对6 种霉菌生长中期（5 d）和后期（13 d）产生的挥发性物质进行检测分析。分别将每个培养皿中的菌株及培养基全部转移至100 mL顶空瓶中，旋盖密封，在40℃恒温水浴中平衡1 h，然后插入固相微萃取头萃取50 min，于GC－MS进样口（250℃不分流模式）解析5 min。参数条件见表1。通过与计算机中NIST08标准质谱库匹配实现样品中挥发性物质的定性分析。

1.3.3 数据分析方法

采用SPSS16.0和MATLAB软件对12个电子鼻金属氧化物传感器响应信号的特征值进行分析处理。通过PCA、LDA和PLS－DA建立不同霉菌样品的判别模型，运用留一交互验证法对模型性能进行验证。

2 结果与讨论

2.1 PCA结果

6 种霉菌生长前期（1、2 d）和中后期（5、13 d）电子鼻传感器的特征响应值的PCA结果如图1所示。观察可知，在生长前期，霉菌整体区分效果不佳。除寄生曲霉类样品区分较好外，黄曲霉类和青霉类样品重叠严重，表明在生长前期，霉菌代谢所产生的特征性挥发性物质较少，整体差异并不明显。相反，在中后期，3类霉菌区分则较为理想，如图1 b所示，未发现有样品发生重叠，表明不同属类菌株所产生的挥发性物质存在明显差异。黄曲霉和寄生曲霉类样品内部发生部分重叠，显示同一菌属的气味特征可能较为相似。PCA结果表明，随着生长过程的持续，不同霉菌代谢所产生的特征气味成分的差异越来越显著，电子鼻具有区分不同气味霉菌样品的潜力［20］。

图1 6种霉菌样品在生长前期及中后期主成分得分图

2.2 GC－MS结果分析

GC－MS检测结果显示6种霉菌的挥发性气味成分主要包括醇类、酮类、烯类、醛类和芳香类物质等。其中，寄生曲霉类和黄曲霉类以挥发性醇类和酮类为主，并含有少量烯类和酯类等，而芳香类、醇类和酮类物质在青霉类挥发性成分中所占比重较大。在生长中期（5 d），其气味组成均存在一定差异。另外，所有霉菌中期均检测出1－辛烯－3－醇和3 － 辛酮，与其他研究结果一致［21－22］，表明其可作为霉菌次级代谢产物的特征挥发性成分。在生长后期（13 d），不同菌属霉菌的特征挥发性物质差异更加显著。黄曲霉类检测出1－辛烯、2－乙基－丁醛和2－乙基－1－己醇等，寄生曲霉类测出1－壬烯－3－醇和3－甲基－4－庚酮等，青霉类含有苯并环庚－1，3－二烯、3，4－二氯苯甲醚、2，5－二氯酚－甲基醚和1－甲基－萘等，表明霉菌在生长过程中，其产生的挥发性物质种类逐渐增加，增加了其特异性。

2.3 LDA结果

根据霉菌属类不同，将所有样品分为3类：黄曲霉类（黄曲霉3.395 0、黄曲霉3.17）、寄生曲霉类（寄生曲霉3.124、寄生曲霉3.395）和青霉类（黄绿青霉3.99、岛青霉3.260）。将PCA提取的前10个主成分得分导入SPSS软件建立LDA模型，运用留一交互验证法进行验证，结果如表2所示。观察可知，电子鼻对生长前期（1、2 d）样品的判别正确率不佳，整体正确率仅为70.8%。其中，16个黄曲霉类样品中仅有2个样品判别错误，效果最优。而青霉类样品正确率最低，有8个样品被误判为黄曲霉类。然而，模型对中后期（5、13 d）样品的判别能力显著提升，没有1个样品被误判，正确率达到100%。结果表明，LDA与PCA结果具有一致性，在生长中后期，不同菌属的霉菌样品在气味上存在显著差异。电子鼻能够判别不同菌株样品，且样品间的气味特征差别越大，判别能力越强。

表2 3类霉菌样品的留一交互验证LDA模型判别结果

2.4 PLS－DA结果分析

为比较不同分析方法对结果的影响，运用PLSDA方法建立3类霉菌样品的分析模型，结果如表3所示。在生长前期（1、2 d），黄曲霉类、寄生曲霉类和青霉类样品判别正确率均不高，只有寄生曲霉结果相对较优。有17个样品被误判为黄曲霉类，导致其特异性仅为59.4%。生长中后期（5、13 d），模型精度大幅提升，整体正确率达97.4%。黄曲霉类和寄生曲霉类均判别正确，仅有2个来自青霉类的样品被误判。PLS－DA模型建模因子的权重得分（LVs）如图2所示。与PCA得分图类似，生长前期样品的分类趋势不显著，中后期3类样品区分明显，未发现重叠。LDA与PLS－DA结果较为一致，对中后期霉菌样品的判别率高，表明电子鼻技术结合多元统计分析方法可以实现霉菌菌属的快速鉴定。

表3 3类霉菌样品的留一交互验证PLS－DA模型判别结果

图2 6种霉菌在生长前期和中后期PLS－DA模型权重得分图

2.5 电子鼻传感器响应信号分析

电子鼻12个金属氧化物传感器的权重得分如图3所示。对各个传感器响应灵敏的特征挥发性物质成分如表4所示。观察可得，S1和S10第3权重得分较高，对含氟、氯等元素化合物较为敏感，可能与样品中3，4－二氯苯甲醚和2，5－二氯酚－甲基醚等强氧化性物质有关。而S2、S3、S4、S5和S6同属于LY型传感器，适合可燃性及毒性有机化合物，权重较为相似，可能主要与样品中醇类、醛类以及培养基中烷烃类物质有关。S7、S11和S12这3个传感器第1权重得分较高，对芳香族类等有机化合物响应灵敏度较好，可能与样品中苯并环庚－1，3－二烯和1－甲基－萘等芳香类物质相关。S8和S9存在响应重叠，皆适用于烷烃类等碳氢化合物，与培养基自身的挥发性成分有关。分析结果显示，由于不同样品的气味特征存在差异，而电子鼻传感器对不同挥发性物质成分的响应有所区别，使得样品的区分成为可能。

图3 霉菌样品生长中后期（5、13 d）电子鼻传感器权重得分图

表4 电子鼻气体传感器性能表

3 结论

利用电子鼻和GC－MS技术对6种霉菌在不同生长阶段的挥发性气味物质进行了检测分析，结果发现在生长前期（1、2 d），各种霉菌产生气味特征较少，导致电子鼻对3类霉菌样品的判别结果不佳。在生长中后期（5、13 d），霉菌生长代谢产生大量特征挥发性成分，GC－MS结果显示不同类霉菌气味信息差异显著，电子鼻判别正确率高，LDA和PLS－DA模型的判别正确率均在95%以上。结果表明，运用电子鼻和GC－MS技术，结合多元统计分析方法，可以对粮食中的霉菌情况进行快速鉴定［23－24］。下一步应当以谷物样品为研究对象，研究其受不同霉菌感染的气味特征，以及与电子鼻信号的相关关系，为电子鼻技术尽早应用于粮食霉变状态实时监测提供理论依据。

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Electronic Nose and GC－MSDetection of Volatile Substances Produced by Mould Strains

Shen Fei Wu Qifang Wei Yingqi Du Lihui Tang Peian
（College of Food Science and Engineering／Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety／Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing，Nanjing University of Finance and Economics，Nanjing 210023）

In order to establish a rapid method for mould contamination detection in grain，electronic nose and gas chromatography mass spectrometry（GC－MS）technologies were applied to analyze volatile compounds produced by six common mould strains at different stages of growth（1，2，5，13 d）in this study.Results of GC －MSshowed that the distinction of volatile substances between different moulds exists and became more significant at a late growth stage.Principal component analysis（PCA）based on electronic nose signal could effectively distinguish mould strains from different species at later stages（5 and 13 d）.The overall correct discrimination rate for aspergillus flavus，parasitic aspergillus and penicillium species obtained by linear discriminant analysis（LDA）and partial least squares discriminant analysis（PLS－DA）are 100%and 97.4%，respectively.The results demonstrate that the use of electronic nose and GC－MStechnologies might be feasible for rapid detection of mould contamination of grain.

grain，mould contamination，electronic nose，GC －MS，rapid detection

TS210

A

1003－0174（2016）07－0148－06

国家自然科学基金青年基金（31301482），粮食公益性行业科研专项（201313002－02），“十二五”国家科技支撑计划（2013BAD17B01），江苏高校优势学科建设工程（2014年1月—2017年12月）

2014－11－30

沈飞，男，1984年出生，讲师，粮油食品检测

都立辉，男，1981年出生，副教授，食品微生物与生物技术