二氧化氯对几种主要真菌毒素的降解效果研究

常晓娇 王 峻 孙长坡 刘虎军 伍松陵 孙 晶 吴子丹

二氧化氯对几种主要真菌毒素的降解效果研究

常晓娇1，2王 峻2孙长坡2刘虎军2伍松陵2孙 晶2吴子丹2

（河南工业大学粮油食品学院1，郑州 450001）
（国家粮食局科学研究院2，北京 100037）

研究了不同浓度的ClO2对黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、呕吐毒素（DON）和伏马毒素B1（FB1）4种主要真菌毒素的降解作用，结合粮食加工工艺及ClO2的使用状态，评价了其在液体和气体2种状态下对玉米粉及其副产物中ZEN的降解效果。结果表明，500 mg／L ClO2对10μg AFB1、25μg ZEN、25μg FB1处理24 h，降解率分别为100%、100%、66%，而对DON无降解效果。对污染玉米及其副产物中ZEN的降解能力进一步研究，结果表明，pH值为中性的玉米粉样品，采用液体浸泡的方法降解效果更好，300 mg／L的ClO2处理5 h即可把ZEN的含量从7 073μg／kg降至495μg／kg；而对于pH值为4、ZEN含量为7 646μg／kg的燃料乙醇生产过程中产生的废醪样品，处理20 h的ZEN降解率为57%。

二氧化氯 真菌毒素 降解 玉米副产物 化学脱毒

真菌毒素是由多种产毒真菌在粮食的种植、收获、运输、储存过程中侵染并产生的次生代谢产物［1］。在我国，常见的真菌毒素主要有黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮（ZEN）、呕吐毒素（DON）、伏马毒素等，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）毒性最高，而伏马毒素B1（FB1）是伏马毒素的主要组分。这些真菌毒素广泛存在于玉米、大麦、小麦、花生、乳制品等食品及饲料中［2］，对人畜健康造成了巨大的威胁［3-4］，也对我国的对外贸易、畜牧养殖等造成了极大的经济损失［5-6］。

目前，针对真菌毒素脱毒开发的方法主要分为物理方法、化学方法和生物方法，传统的化学方法不但效果不理想，在安全性上往往也存在着一定的弊端［7］。二氧化氯（ClO2）作为被WHO、FDA 等组织公认安全、无毒的绿色消毒剂，具有氧化性强、杀菌能力好等特点，已经广泛应用于自来水消毒［8-9］、空气杀菌［10］、水产和禽畜养殖［11］及医疗［12］等领域。研究表明，ClO2对黄曲霉毒素有很好的脱毒效果，如李建辉等［13］用10 g／L 的ClO2溶液，以5∶1 的料液比（mL／g）浸泡黄曲霉毒素污染花生，处理后黄曲霉毒素含量小于20μg／kg，但至今鲜见ClO2对伏马毒素及玉米中ZEN的脱毒研究报道。

本研究利用ClO2的强氧化能力，测定其对3种真菌毒素标准品的降解效果，并分别以ClO2气体熏蒸和液体浸泡的方式处理ZEN污染玉米粉及其副产物，探究粮食及其副产物中ZEN的ClO2处理方式和使用浓度，以期为真菌毒素污染粮食及饲料的化学脱毒提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

供试真菌毒素标准品：北京泰乐祺科技有限公司；玉米粉及玉米副产物：某玉米深加工企业；ClO2消毒液：深圳市罗奇环保科技有限公司；玉米赤霉烯酮免疫亲和柱：北京中检维康生物技术有限公司；XBridgeR C18液相色谱柱：沃特世科技（上海）有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯）：天津博纳艾杰尔科技有限公司。

希洁ClO2发生器（XJ-02型-1）：深圳市罗奇环保科技有限公司；冷冻干燥机：美国Labconco公司；Infors HT摇床：伊弗森生物技术（中国）有限公司；实验室高剪切乳化机（MX021 MXR系列）：上海沐轩实业有限公司；高效液相系统（Waters 2695）：美国沃特世（Waters）科技有限公司；Agilent 6510 Q-TOF LC／MS：美国安捷伦科技公司。

1.2 研究方法

1.2.1 ClO2对真菌毒素标准品的降解效果

将ClO2发生器与容积为500 L、密闭性良好的玻璃容器相连，同时设置1根与进气管相同的排气管，将容器内多余气体排入大气中，以保证在发生器稳定工作过程中容器内部气体压力和ClO2浓度恒定不变。

分别取一定量的AFB1、ZEN、DON和FB1标准品溶液置于离心管中，离心干燥，使管中毒素含量分别为10、25、25、25 μg，备用。

将ClO2发生器转数调至2 r／h，使其和容器连接并稳定工作1 h，此时容器内的ClO2气体浓度为100

mg／L。分别将提前制好的3种毒素管若干支放入容器中，离心管开口远离进气口，并立刻盖好容器，待反应分别进行至不同时间取样待测。

将ClO2发生器转数调至11 r／h，稳定工作1 h后，容器内的ClO2气体浓度为500 mg／L，毒素管放置和取样方法不变。

将样品复溶于1 mL无水乙醇中，待高效液相色谱（HPLC）检测。

1.2.2 ClO2对玉米及其副产物中ZEN的降解效果评价

待处理样品为玉米粉、酒糟蛋白（DDGS，用于熏蒸法）、废醪（用于浸泡法）、玉米副产物混合物，其中玉米粉pH值为偏中性，DDGS和废醪pH值为4左右，玉米副产物混合物由玉米深加工过程中产生的副产物按一定比例混合烘干而成，主要包括玉米皮、玉米浆、玉米粕、粗蛋白、糖渣等，pH值为5左右。每个处理取玉米粉或玉米副产物干基10 g，每个处理设3个重复。

由于ClO2主要以气体和液体2种状态使用，因此，该部分研究分别采用2种方法处理：1）气体熏蒸法：将ClO2发生器调至2 r／h，待稳定后分别放入待测的玉米粉、DDGS、副产物混合物，均匀平铺在直径为12 cm的定性滤纸表面，并于处理不同时间取样，烘干待测。2）液体浸泡法：取待处理的玉米粉及玉米副产物混合物样品若干份，向其中加入适当无菌蒸馏水至一定体积，以500 mg／L的ClO2浓液体为原液，取适当量加入装有水的待测样品中，使处理终浓度分别为50、100、300 mg／L，终体积300 mL（具体添加量如表1所示）。迅速转移至500 mL摇瓶中，于30℃，100 r／min恒温培养，不同时间取样，烘干待测。

表1 液体浸泡法处理玉米及其副产物ClO2添加量

准确称取5 g经研磨的烘干样品，加入1 g NaCl置于烧杯中，加入50 mL 乙腈／水＝90／10（V／V），3 000 r／min乳化3 min，收集滤液，并将其用蒸馏水稀释5倍，取10 mL稀释后的萃取液过ZEN免疫亲和柱，最后用1 mL无水甲醇洗脱于液相瓶中待HPLC检测。

1.2.3 高效液相色谱检测条件

AFB1检测条件：参照GB／T 18979—2003［14］；ZEN 检测条件：参照GB／T 23504—2009［15］；DON 检测条件：参照GB／T 23503—2009［16］；FB1检测条件：参照GB／T 25228—2010［17］。

1.2.4 ZEN降解产物的初步鉴定

分别对ClO2气体熏蒸ZEN标准品12 h和24 h样品进行质谱分析。

色谱柱Agilent poreshell 120 EC-C18，2.1×100 mm；液相系统流速0.3 mL／min；柱温40 ℃；上样量3μL；流动相A：H2O＋0.1% 甲酸＋5 mM NH4Ac；B：甲醇＋0.1%甲酸。流动相比例如表2所示。

表2 流动相的洗脱比例／%

2 结果与讨论

2.1 ClO2对几种真菌毒素的降解效果

分别用2种不同浓度的ClO2气体处理4种真菌毒素标准品的结果显示，ClO2对AFB1、ZEN、FB1均有降解效果，并且随着浓度的增加和时间的延长，降解效果随之提高。如图1a所示，浓度为100 mg／L熏蒸含量为10μg的AFB1毒素管，处理1 h时降解曲线斜率最大，之后逐渐变小，在处理24 h时降解效果达到89%，40 h时无检出。而在500 mg／L的ClO2气体处理过程中6 h即无检出，说明ClO2与AFB1迅速反应，使其在短时间内被降解。

对ZEN的试验过程中（图1b），2种浓度ClO2气体处理效果差异显著，500 mg／L的ClO2熏蒸0.5 h即可使ZEN降解5.75μg，而100 mg／L浓度处理40 h，被降解的ZEN也只有8μg。说明ClO2与真菌毒素的反应是瞬时的，当达到一定浓度时，其在短时间内就可使大量真菌毒素分解，并且能够看出，与提高ClO2使用浓度增加降解效果相比，进一步延长处理时间虽能使降解作用效果在一定程度上有所提高，但降解效果并不显著。

500 mg／L ClO2对DON处理40 h，处理后样品峰形与对照完全重合，说明ClO2在此条件下对DON无降解效果。

图2为浓度为500 mg／L的ClO2对FB1的熏蒸效果，可以看出，在处理48 h时，25μg的FB1降解率为81%，而使用较低浓度100 mg／L熏蒸的降解效果较低，48 h时仅为8%。

综上，ClO2在较高浓度下可以与AFB1、ZEN、FB1发生瞬时反应，并随着处理时间的延长，反应效果会有一定的提高。其中，对AFB1和ZEN的降解效果最为显著，而对FB1的效果相对差些，对DON无降解效果。

图1 ClO2对AFB1和ZEN的降解效果

图2 ClO2浓度为500 mg／L对FB1的降解效果

2.2 ClO2气体熏蒸法对玉米粉及副产物的降解效果

由于发生装置在制备大量、高浓度ClO2气体时尚存在技术瓶颈，而在储存、使用过程中也存在安全隐患以及高能耗的问题，因此，针对玉米及其副产物中的ZEN污染现状，本研究选用浓度为100 mg／L的ClO2气体熏蒸ZEN超标玉米及其副产物。为了增加样品与ClO2的接触面积、提高降解效果，试验中的样品均被粉碎成粉末，分别熏蒸至6.5、48、72 h取样、过亲和柱，并利用HPLC检测毒素残留量。

如表3所示，在处理6.5 h时，玉米粉、玉米副产物混合物、DDGS中ZEN的降解率分别为13%、23%和0，而未处理前，三者的ZEN含量分别为7 073、3 187 和7 646 μg／kg，每处理称取10 g，ZEN总含量远低于标准品试验中的25μg，这说明ClO2在与ZEN反应的同时，也与样品中的其他物质反应，增加样品与ClO2的接触面积也增加了样品中有机物与ClO2的反应。延长熏蒸时间，72 h时，3种待处理样品中ZEN 含量分别为495、159、3 746 μg／kg，其中玉米粉和玉米副产物混合物经过处理均降至国家限量标准500μg／kg以下，而对pH值为4的DDGS的处理效果不好。

表3 100 mg／L ClO2对玉米粉及其副产物的熏蒸效果

2.3 ClO2液体浸泡法对玉米粉及副产物的降解效果

待处理样品分别与不同浓度二氧化氯混合后放置于恒温摇床中，30 ℃，150 r／min培养5 h，20 h取样检测结果表明，经浓度为300 mg／L ClO2浸泡玉米粉5 h后ZEN含量即可降至国家限量标准以下（如图3a）。但随着时间的延长，ClO2对ZEN的降解速率降低，并且在pH值为4（如图3c）的废醪中明显比另外2种pH值为5（如图3b）和pH为中性的样品中对ZEN的降解效率差。这是因为ClO2在反应初始即迅速消耗、浓度降低，在中性样品中，ClO2与水分子生成大量氯酸和亚氯酸，提高了其在反应中的氧化性。而在酸性样品中，氯酸和次氯酸由于溶液中氢离子的大量存在而使可逆反应向解离方向进行，降低了氧化效率，从而降低了ZEN的降解效果。

图3 不同浓度ClO2液体对玉米粉及其副产物中ZEN的降解效果

2.4 ZEN降解产物的初步分析

HPLC-MS 结果显示，500 mg／L ClO2处理ZEN标准品12 h后未提取到荷质比为317.139 4的ZEN物质峰（如图4），对图4b中“1”位置的可能降解产物峰进一步质谱分析发现，丰度较高的物质分别是荷质比为m／z＝351.129 4和385.093 8，以及分子质量较小的206.989 1（如图5a）。推测可能是氯原子与ZEN中苯环发生了取代反应，或在共轭烯烃位置发生了加成反应，从而产生了上述几种新物质。而在24 h处理后的样品中，只在14.741 min时检测到较高丰度的物质（如图4c），其荷质比为m／z＝283.266 1（如图5b）。说明随着时间的延长和ClO2的及时补充，ClO2不断与ZEN发生多步氧化反应，从而产生多个中间产物。这与Stewart DJ等［18］在ClO2充足的情况下，会与色氨酸发生多步氧化反应的结论一致。因此，在ClO2处理的产物中应该包括由碳、氢、氧、氯组成的有机物及一些小分子物质，而产物的具体结构和种类，以及降解机理还需要结合核磁共振等手段进一步探究和解析。

图4 经500 mg／L ClO2处理ZEN离子流图

图5 ZEN降解产物液质联用分析

3 结论

在保证ClO2浓度恒定的前提下，ClO2可通过瞬时的化学反应降解AFB1、ZEN、FB1，并且在该氧化还原反应中，ClO2的浓度是反应的重要限速因素。另外，为确定降解产物的安全性，还需要对反应产物的结构和毒性做进一步深入解析。

对玉米粉及其副产物中ZEN开展的降解试验中发现，在使用相同ClO2浓度的条件下，液体浸泡法比气体熏蒸法效果更为显著，其中对中性样品的降解效果较酸性样品好。在ClO2对ZEN的降解过程中可能发生苯环取代和共轭烯烃的加成反应，产生了含氯的有机化合物及几种小分子物质，产物的具体结构和降解机理需要进一步的研究确定。

由于ClO2具有强氧化性，但缺乏专一性的特点，可与自然界中绝大多数物质反应，因此，试验中ClO2除了可与真菌毒素反应，也能与玉米及其副产物中的有机物质反应，在不继续补充ClO2的前提下，随着反应物的不断消耗，ZEN的降解效率逐渐降低，直至停止，同时也可能造成玉米及其副产物中营养成分的损失。在此过程中生成物质的毒性和营养物质的损失情况还需进一步深入分析。另外，在实际生产中由于ClO2的强氧化性还可能对设备或设施造成腐蚀，以及使用高浓度的ClO2气体易燃爆的特点，因此ClO2在实际生产中的应用条件等还需要进一步的研究。

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Research on Degradation of Chlorine Dioxide in Primary Mycotoxins

Chang Xiaojiao1，2Wang Jun2Sun Changpo2Liu Hujun2Wu Songling2Sun Jing2Wu Zidan2
（College of Food Science and Technology，Henan University of Technology1，Zhengzhou 450001）
（Academy of State Administration of Grain2，Beijing 100037）

This paper studies the degradation of chlorine dioxide of different concentrations in four primary mycotoxins such as aflatoxin B1（AFB1），zearalenone （ZEN），deoxynivalenol（DON）and fumonisins B1（FB1）.and evaluates the degradation of chlorine dioxide under liquid and gas state in ZEN in maize flour and its byproducts with combination of food processing technology and chlorine dioxide application conditions.The results show that except for no degradation in DON，the degradation rates of 10μg AFB1，25μg ZEN，25μg FB1treated by chlorine dioxide of 500 mg／L for 24 h were 100%，100%，66%，respectively.The results of further research on the degradation in ZEN in polutted corn and its byproducts show that the chlorine dioxide liquid immersion method to deal with the maize flour sample with neutral PH works better，the level of ZEN degraded from 7 073 μg／kg to 495 μg／kg when treated for 5 h by chlorine dioxide at the concentration of 300 mg／L.However，for waste mash sample treated for 20 h and generated during production of the fuel ethanol whose pH value is 4 and ZEN content was 7 646 μg／kg，ZEN degradation rate was 57%.

chlorine dioxide，mycotoxin，degradation，maize byproducts，chemical detoxification

S513

A

1003-0174（2016）09-0113-06

时间：2016-08-10 17：20：21

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／11.2864.TS.20160810.1720.004.html

国家科技支撑计划（2015BAK43B02），粮食公益性行业科研专项（201513006）

2015-11-12

常晓娇，女，1984年出生，博士，粮油微生物与质量安全

吴子丹，男，1955年出生，研究员，粮油储藏