PPARα 激活对高脂饮食诱导的大鼠非酒精性脂肪性肝病的保护作用

李宗先，韩 真，汪再炎

皖南医学院附属弋矶山医院消化内科，安徽 芜湖241000

目前，国内外非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)被公认为是引起慢性肝脏疾病、肝功能异常最常见病因［1］。过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)属于激素核受体超家族成员之一，主要包括PPARα、PPARβ、PPARγ 3 种亚型，PPARα 在肝脏细胞中高表达，具有调节胆汁酸代谢、脂肪酸摄取、活化，并影响细胞内脂肪酸结合及线粒体脂肪酸氧化［2-3］。近年来，越来越多的研究表明，PPARα 在脂肪肝的发病机制中有显著作用。本研究中，我们主要探讨PPARα 激动剂WY14643 对高脂饮食诱导的大鼠NAFLD 的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择4 周龄SPF 级SD 雄性大鼠60 只。

1.2 主要试剂和仪器 WY14643(Sigma 公司)，PPARα 胆盐输出泵(Bsep)抗体(Santa Cruz 公司)。RT-PCR 试剂盒(大连宝生物公司)，实时荧光定量PCR 仪(ABI 7500)，全自动生化分析仪(Roche Modular DPP，瑞士)。

1.3 NAFLD 大鼠模型建立及分组 将大鼠喂养1周后随机分为3 组，每组20 只，Ⅰ组以标准饲料喂养，Ⅱ组以高脂饲料喂养，Ⅲ组高脂饲料喂养，同时每日腹腔内注射WY14643 1 mg/kg，Ⅰ组和Ⅱ组每日腹腔内注射等量的生理盐水。继续喂养2 周后，处死全部大鼠。

1.4 标本采集 处死大鼠前禁食12 h，摘出肝脏切取相同部位肝组织，并用10%甲醛缓冲液固定，用于观察肝脏病理变化，其余组织储存于液氮中，用作提取总RNA 和蛋白。

1.5 测定血清生化指标 用全自动生化分析仪检测3 组大鼠血清TBA、TG、TC、AST、ALT 变化。

1.6 大鼠肝脏病理切片 将分离出的大鼠肝脏组织，经HE 染色后，在倒置显微镜下观察其病理学改变。

1.7 RT-PCR 检测 按操作说明合成cDNA，引物设计PPARα (F:5＇-TAGCTATCCATTGTTGC-3＇，R:5＇-GCACTGAGTCGATCTCTTA-3＇)，Bsep (F:5＇-AGCGTAGCTTCCACCAAGC-3＇，R:5＇-GTACCGACTGACTCTAT-3＇)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(F:5＇-ACTGTGTGTTATGAGGT-3＇，R:5＇-AATGAGTCCAGCTGACGT-3＇)。PCR 扩增条件，PPARα:95 ℃30 s，95 ℃5 s，58 ℃34 s;Bsep:95 ℃30 s，95 ℃5 s，56 ℃34 s。采用2-ΔΔCT值法计算目的基因相对表达量，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参对照，Ⅰ组基因mRNA 相对表达量设为1，各组实验独立重复3 次，统计分析。

1.8 Western blotting 检测 用裂解液提取肝脏组织总蛋白，调整3 组蛋白上样量，使各组上样量相等，在12%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，然后转移至聚偏二氟乙烯膜，5%BSA 封闭1 h，分别用PPARα、Bsep 及GAPDH 的一抗与膜结合，4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜后，分别与辣根过氧化物酶标记的二抗结合，室温孵育1 h，经ECL 化学发光法显色，Quantity One 软件测灰度值，以PPARα、Bsep/GAPDH 吸光度比值表示。

1.9 统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件进行分析，多组均数间比较用单因素分析，2 组均数间比较用LSD 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肝脏病理学变化 Ⅰ组大鼠肝脏肝小叶结构完整。Ⅱ组可见肝细胞不同程度的空泡变性、脂肪变性，Ⅲ组大鼠肝细胞变性坏死、脂肪变性及炎细胞浸润与Ⅱ组比较均有所减轻(见图1)。

图1 大鼠肝脏病理改变(HE 200 ×) A:Ⅰ组;B:Ⅱ组;C:Ⅲ组Fig 1 Rat liver pathology (HE 200 ×) A:Ⅰgroup;B:Ⅱgroup;C:Ⅲgroup

2.2 大鼠血清生化指标变化 与Ⅰ组比较，Ⅱ组大鼠血清TBA、TG、TC、AST、ALT 明显升高(P ＜0.01);与Ⅱ组比较，Ⅲ组大鼠血清TBA、TG、TC、AST、ALT 明显降低(P ＜0.05，见表1)。

表1 大鼠血清生化指标(±s，n=3)Tab 1 Serum biochemical parameters of rats (±s)

表1 大鼠血清生化指标(±s，n=3)Tab 1 Serum biochemical parameters of rats (±s)

注:与Ⅰ组比较，aP ＜0.01;与Ⅱ组比较，bP ＜0.01，cP ＜0.05。

组别 AST(U/L) ALT(U/L) TBA(μmol/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L)Ⅰ组 83.33 ±15.57 41.67 ±8.50 28.25 ±6.10 0.47 ±0.16 1.08 ±0.14Ⅱ组 151.00 ±21.52a 91.00 ±8.19a 82.06 ±18.23a 1.00 ±0.19a 2.43 ±0.60aⅢ组 103.00 ±15.52b 58.00 ±7.00c 51.48 ±14.49c 0.66 ±0.11c 1.54 ±0.31 c

2.3 大鼠肝脏组织PPARα、Bsep mRNA 表达 与Ⅰ组比较，Ⅱ组大鼠肝脏组织PPARα、Bsep mRNA 明显降低(P ＜0.05);与Ⅱ组比较，Ⅲ组大鼠血清PPARα、Bsep mRNA 明显升高(P ＜0.01，见图2)。2.4 大鼠肝脏组织PPARα、Bsep 蛋白表达 与Ⅰ组比较，Ⅱ组大鼠肝脏组织PPARα、Bsep 蛋白明显降低(P ＜0.05);与Ⅱ组比较，Ⅲ组大鼠血清PPARα、Bsep蛋白明显升高(P ＜0.01，见图3)。

图2 大鼠肝脏组织PPARα、Bsep mRNA 表达Fig 2 Expressions of PPARα，Bsep mRNA in liver tissues of rats

图3 Western blotting 分析PPARα、Bsep 蛋白表达Fig 3 Expressions of PPARα，Bsep protein by Western blotting analysis

3 讨论

目前有关肝脂肪变性的病理生理机制尚不完全清楚，NAFLD 由于脂肪变性可进展为非酒精性脂肪性肝炎，进一步发展可发生脂肪性肝纤维化，最终导致肝硬化和肝癌［4］。由此可见，对于NAFLD 的早期干预及保护至关重要。

PPARα 属于核转录因子，在肝脏细胞中可通过调控相关基因的表达，抑制炎症因子的产生和释放，减轻氧化应激反应对肝脏组织的损伤作用［5］。PPARα 激动剂可通过上调肝脏极低密度脂蛋白受体，降低甘油三酯，调节脂质代谢［6］。Fidaleo 等［7］研究发现，高脂饮食会增加小鼠肝脏脂肪储存和氧化应激，PPARα 介导这一过程，高脂饮食可下调小鼠肝脏细胞PPARα 表达，且关闭PPARα 信号，从而降低β 氧化和过氧化氢酶活性。本实验结果显示，Ⅱ组的大鼠血清TBA、TG、TC、AST、ALT 等生化指标较Ⅰ组明显升高，肝脏组织中PPARα 表达明显下调，表明高脂饮食可下调PPARα 表达，与之前研究结果一致。PPARα 激动剂WY14643 经大鼠腹腔注射后，大鼠肝脏组织中PPARα表达明显增高，同样高脂饮食诱导大鼠NAFLD，结果发现Ⅲ组大鼠血清TBA、TG、TC、AST、ALT 等生化指标较Ⅱ组明显降低，同时病理切片显示，Ⅲ组大鼠肝细胞变性坏死、脂肪变性及炎性细胞浸润较组Ⅱ明显减轻，以上结果提示PPARα 激动剂WY14643 对高脂饮食诱导的大鼠NAFLD 具有保护作用。

PPARα 激动剂WY14643 对高脂饮食诱导的大鼠NAFLD 保护作用的潜在机制可能与Bsep 有关。Bsep是肝脏毛细胆管膜上胆汁酸外排的主要转运体，Bsep功能异常可影响胆汁酸外排障碍，最终导致肝脏胆汁淤积［8］。肝脏脂肪变性与脂质代谢紊乱关系密切，Bsep 表达量会影响胆汁淤积，从而影响肝脂肪变性。本研究结果发现，当高脂饮食下调PPARα 表达时，Bsep 表达量同时降低，大鼠肝脏组织脂肪变性严重。当PPARα 激动剂WY14643 作用后，PPARα 表达量明显升高，Bsep 表达量同时升高，此时，大鼠肝脏组织脂肪变性较单纯高脂饮食诱导组明显减轻。由此可见，WY14643 可通过激活PPARα 而上调Bsep 表达，进而起到对肝脂肪变性的保护作用。

综上所述，PPARα 激活可保护高脂饮食诱导的大鼠NAFLD，其机制可能是PPARα 激活后上调Bsep 表达，减轻肝脏细胞胆汁淤积，但其具体信号通路有待进一步深入研究。

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