补肾止颤方联合埋针疗法对帕金森病模型大鼠Bcl-2及Bax表达的影响

补肾止颤方联合埋针疗法对帕金森病模型大鼠Bcl-2及Bax表达的影响

胡玉英陈薇1

(广西中医药大学第一附属医院脑病科,广西南宁530023)

摘要〔〕目的观察补肾止颤方联合埋针疗法对帕金森病(PD)模型大鼠中脑黑质区Bcl-2及Bax蛋白的影响，探讨补肾止颤方联合埋针疗法对PD大鼠神经元细胞凋亡的保护作用。方法采用蛋白酶抑制因子(PSI)皮下注射法制作慢性PD大鼠模型，HE染色观察各组大鼠中脑黑质区病理形态学改变，免疫组织化学方法检测Bcl-2及Bax蛋白在中脑黑质区表达的变化。结果PD模型组大鼠Bcl-2及Bax表达均较假手术组明显增高，中脑黑质区病理改变严重；补肾止颤方联合埋针疗法治疗后的PD大鼠Bcl-2表达明显增高，Bax表达明显降低，中脑黑质区病理变化明显改善。结论补肾止颤方联合埋针疗法能明显提高PD模型大鼠中脑黑质区Bcl-2蛋白的表达及抑制Bax蛋白激活，从而抑制黑质细胞凋亡以发挥脑保护作用。

关键词〔〕补肾止颤方；帕金森病；埋针；Bcl-2；Bax

中图分类号〔〕R742.5〔文献标识码〕A〔

1广西中医药大学

第一作者：胡玉英(1970-)，女，副主任医师，副教授，硕士，硕士生导师，主要从事中西医结合防治帕金森病、老年期痴呆等。

补肾止颤方由龟鹿二仙膏合大定风珠化裁而来。龟鹿二仙膏具有生精、益气、养血、阴阳并补，补阴而无凝滞之弊，补阳而无燥热之害；大定风珠具有育阴潜阳，柔肝熄风功效。而埋针疗法治疗疾病的记载最早见于《素问·刺要论》：“所谓刺皮无伤肉者，病在皮中，针入皮下，无伤肉也”，它有进针表浅、得效迅速、少用手法、极少痛苦、操作方便、疗效持久的特点，具有疏通经络，调理气血，平衡阴阳，补泻虚实功效。补肾止颤方联合埋针疗法则具有滋养肝肾、益精填髓、补气养血、疏通经络、熄风止颤之功。本课题组在临床上运用补肾止颤方联合埋针疗法治疗帕金森病(PD)患者，能明显改善患者的身心健康，使患者运动功能和生活质量进一步提高，取得较满意疗效，但其确切的作用机制并不十分清楚。本研究采用刘雨清等〔1〕蛋白酶抑制因子(PSI)皮下注射法制作慢性PD大鼠模型，通过HE染色观察各组大鼠中脑黑质区病理形态学改变以及免疫组织化学方法检测Bcl-2及Bax蛋白在中脑黑质区表达的变化，探讨补肾止颤方联合埋针疗法对PD大鼠黑质神经元细胞保护作用的机制。

1材料与方法

1.1动物成年雄性SPF级SD大白鼠32只，体重(250±20)g，由广西医科大学实验中心提供。

1.2药物及针具①补肾止颤方(由鹿角胶10 g、阿胶10 g、生龟板20 g、党参15 g、枸杞子30 g、白芍30 g、生地25 g、火麻仁15 g、麦冬15 g、炙甘草6 g、生鳖甲15 g、肉苁蓉30 g、天麻15 g、黄精10 g、山萸肉10 g、钩藤30 g组成)，为单味免煎颗粒(由江苏省江阴市江阴天江药业有限公司制备，生产批号：1206003)；参照《现代医学实验动物学》计算给药量，药物配制成含生药2.574 g/ml，灌胃液体量为每次1 ml/100 g大鼠，其浓度及等效剂量按体表面积折算。②美多巴片由上海罗氏制药公司提供(批准文号：国药准字SH10930198，产品批号：SH1443)，每片250 mg；③埋针针具：选取图钉型无菌揿针针具(苏州市华伦医疗用品有限公司生产的顺和牌无菌揿针，批号：11101)。

1.3主要试剂PSI购自Calbiochem公司；Bcl-2和Bax免疫组化抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；其他试剂均为市售、分析纯。

1.4主要仪器组织包埋机和自动组织脱水机(广州市华俊医疗器械有限公司)，组织切片机(LEICA RM2235)，生物组织烤片机(湖北省孝感市亚光医学电子技术有限公司)，三用电热恒温水温箱(上海跃进医疗器械厂)，光学显微镜(OLYMPUS BX60)。

1.5方法

1.5.1动物筛选大鼠购进后饲以标准的大鼠合成饲料常规饲养，观察1 w无异常后进行实验，整个实验过程中动物自由摄食饮水。实验期间每日观察并记录各组大鼠的体毛、梳理动作、站立次数、肢体震颤、僵直等行为。造模结束后的4w内未出现行为学改变的模型为制作失败，不纳入本实验，同时术中死亡大鼠及时补充，用同一批次的大鼠制成成功模型后保证实验动物每组数量不变。

1.5.2埋针处方百会、肝俞、肾俞、舞蹈震颤区。

1.5.3模型制备及分组参照刘雨清等〔1〕PSI皮下注射法。PSI溶液配制方法：将室温放置的100%无水乙醇直接倒入PSI小瓶中，迅速旋转溶解，观察，确定其安全溶解无颗粒残存，溶解最好在2 min内完成，然后加蒸馏水，稀释为70%乙醇浓度。制作慢性PD大鼠模型，隔日(每周一、三、五)给予24只大鼠背部皮下注射PSI溶液，75 μl/100 g，连续2 w。将造模成功的大鼠随机分为3组，即模型组，美多巴组，针药结合组；另设8只大鼠为假手术组，予同等量的70%乙醇溶液背部皮下注射。各组大鼠在造模结束4 w后进行行为学观察，根据刘雨清造模成功标准〔1〕筛选合格的PD大鼠(活动减少，运动迟缓，重心降低，肢体僵硬)。各组在造模4 w后连续给药3 w，假手术组、模型组均予1 ml·100 g-1·d-1生理盐水灌胃；美多巴组予美多巴200 mg·kg-1·d-1灌胃；针药结合组予补肾止颤方溶液1 ml·100 g-1·d-1灌胃，同时予埋针疗法，隔天(每周一、三、五)治疗，连续3 w，最后每组8只大鼠进行实验。各组大鼠灌胃给药3 w后，予10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)经腹腔注射深度麻醉大鼠后仰卧固定于手术台上，暴露心脏，止血钳夹住腹主动脉及下腔静脉，用磨顿的10号针头刺入左心室，先快速滴入生理盐水约100 ml，若大鼠两前肢及两肺变白改灌注4%多聚甲醛(0.1 mol/L，pH 7.4)100 ml，灌洗后快速断头取大脑，置于4%的多聚甲醛中固定、脱水、透明并石蜡包埋备用。

1.6观察指标

1.6.1动物行为学观察实验期间每日观察并记录各组大鼠的体毛、梳理动作、站立次数、肢体震颤、僵直等行为。

1.6.2中脑黑质区病理改变的观察常规HE染色，在光学显微镜下观察各组大鼠中脑黑质区细胞形态学改变。

1.6.3中脑黑质区Bcl-2、Bax蛋白表达的测定采用免疫组织化学染色法SABC法〔2〕检测各组大鼠中脑黑质区Bcl-2、Bax蛋白表达的变化，在光学显微镜高倍镜下随机取2 mm×2 mm视野，计算中脑黑质区的Bcl-2、Bax的阳性细胞数，并采用HMIAS-2000高清晰彩色病理图像分析系统对免疫组化切片进行图像分析，测定Bcl-2、Bax免疫组化染色的阳性细胞数。

1.7统计学方法采用SPSS17.0统计软件包进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2结果

2.1动物行为学观察造模大鼠注射PSI结束后，逐渐出现不自主咀嚼，站立次数、梳理动作增多；PSI注射结束后第4周症状较明显，大鼠主要表现为采食量减少、毛发粗糙无光泽、污秽，前爪出现颤抖，行走时重心明显降低，伸展姿态时腹部接触地面，运动迟缓，肢体的伸展缓慢。

2.2中脑黑质区病理变化各组大鼠中脑黑质区HE染色后光镜下观察，可见假手术组中脑黑质区神经元细胞排列整齐密集，形态正常；模型组细胞膜出现明显皱缩，细胞体积明显缩小，胞质明显减少，核膜不完整，神经细胞数量明显减少；而美多巴组和针药结合组中脑黑质区病理变化与模型组比较均有不同程度的改善。见图1。

2.3Bcl-2及Bax蛋白表达Bcl-2、Bax蛋白表达部位在黑质细胞的胞质。与假手术组比较，模型组、美多巴组以及针药结合组Bcl-2及Bax表达均明显增高(P<0.01)；与模型组比较，美多巴组和针药结合组Bcl-2表达亦明显增高，Bax表达明显降低(P<0.01)；而针药结合组与美多巴组比较，则针药结合组Bcl-2表达明显增高，Bax表达明显降低(P<0.05)。见表1。

假手术组

模型组

美多巴组

针药结合组

组别视野Bcl-2Bax假手术组1618.04±0.7214.79±0.80模型组1626.23±1.311)42.02±0.831)美多巴组1635.85±0.811)2)32.10±0.441)2)针药结合组1643.90±1.051)2)3)20.99±0.741)2)3)

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；与美多巴组比较：3)P<0.05

3讨论

流行病学调查显示，目前65岁以上人群中约有百分之一患PD〔3〕。被誉为治疗PD药物“金标准”的左旋多巴制剂，其治疗的“蜜月期”仅3～5年，且其疗效仅仅是症状缓解，不能阻止或延缓神经元丢失的发展，长期使用则出现疗效衰减、症状波动、运动障碍等，临床应用受到极大限制〔4〕，因此有必要寻求更有效的治疗方法和药物。

目前PD发病机制尚未完全明确，研究认为与线粒体功能障碍、氧化应激过度、细胞凋亡等因素相关，但无论是哪种发病机制，最终均表现为黑质致密部多巴胺(DA)能神经元的凋亡。细胞凋亡在PD的黑质DA能神经元死亡中起重要的作用，而参与调控神经元细胞凋亡的基因和蛋白质产物中，蛋白家族Bcl-2和Bax在细胞凋亡过程中发挥着至关重要的作用。本实验说明PSI有导致黑质细胞凋亡的作用，从而使DA神经元减少，最终导致PD的发生。

Bcl-2蛋白是一种膜定位蛋白，具有抑制多种细胞发生凋亡的作用，存在于细胞的线粒体、核膜、内质网膜上〔5〕。它作用于线粒体渗透性转换孔，通过改变线粒体膜的通透性来调节PD细胞凋亡〔6〕，其蛋白表达的增加能减少黑质DA神经元凋亡的作用。Bax蛋白是促细胞凋亡蛋白，它是黑质细胞凋亡的关键启动因素，Bax蛋白作为前凋亡蛋白在启动和诱导黑质细胞凋亡方面起着关键性的作用〔7〕，它既能和形成异源二聚体使Bcl-2蛋白失活，对细胞凋亡有促进作用，又可以自身形成同源二聚体，直接促进凋亡。有研究表明〔8〕，在PD早期采取积极措施，促进Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达，调节细胞凋亡发生的早期环节，阻断病理生理变化向恶性方向发展，可以减轻或消除DA氧化应激引发的神经系统损伤。本实验结果提示补肾止颤方联合埋针疗法能明显抑制Bax蛋白表达及促进Bcl-2蛋白表达，对黑质细胞具有明显保护作用，使DA能神经元凋亡明显减少，从而改善PD症状、延缓PD进展。

本结果表明补肾止颤方联合埋针疗法可明显减轻PSI造成的中脑黑质区细胞凋亡，对DA能神经元具有修复及保护作用，从而促进PD大鼠运动功能的恢复。

总之，本研究表明补肾止颤方联合埋针疗法对PD中脑黑质区细胞凋亡有明显抑制作用，其作用机制可能是通过提高Bcl-2蛋白表达及抑制Bax蛋白激活，从而抑制神经细胞凋亡，修复及保护DA能神经元，从而改善PD临床症状、延缓PD进展。本实验为补肾止颤方联合埋针疗法临床治疗PD患者提供了可靠的实验依据。

4参考文献

1刘雨清，张伟栋，李媛媛，等.一种新的帕金森病动物模型〔J〕.中国临实验动物学报，2007;15(2)：159-60.

2王冬梅，徐红，徐静，等.如何用免疫组化ABC法做好脑组织冰冻切片〔J〕.卫生职业教育，2010;28(2)：118-9.

3Yang YX，Wood NW，Latchman DS.Molecular basis of Parkinson’s disease〔J〕.Neuroreport，2009;20(2)：150-6.

4马云枝，郑太昌，姚静静，等.熄风定颤丸治疗帕金森病肝肾阴虚证临床研究〔J〕.中医学报，2013;28(4)：587-8.

5黄月，张善锋，许予明，等.6-羟基多巴胺诱导帕金森病大鼠相关蛋白及mRNA 的表达〔J〕.郑州大学学报(医学版)，2011;46(2)：222-5.

6徐晓露，施建生.神经元凋亡在帕金森病中的作用〔J〕.医学综述，2012;18(7)：1004-6.

7丁宏娟，何建成.涤痰汤对帕金森病大鼠神经细胞凋亡及相关基因表达的影响〔J〕.辽宁中医杂志，2010;37(4)：740-1.

8严丽荣，周亚平，苗曼悌，等.中药联合褪黑素对帕金森模型大鼠前脑纹状体细胞凋亡和行为学的影响〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(21)：2769-72.

〔2013-11-06修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)