粪便中SFRP2基因甲基化与大肠癌的相关性

粪便中SFRP2基因甲基化与大肠癌的相关性

贾凤洁孙冬生徐龙健1刘宁曹立赢2

(唐山开滦总医院肿瘤科，河北唐山063000)

摘要〔〕目的探讨粪便中的分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)2基因甲基化对大肠癌患者的诊断价值。方法选取2011年12月至2013年12月该院经病理检查确诊的52例大肠癌病人及32例结肠镜阴性的健康者(对照组)。通过亚硫酸氢盐的限制酶法(COBRA)检测大肠癌52例粪便中SFRP2基因启动子两个区域(区域1和区域2)甲基化状态，分析SFRP2基因甲基化与肿瘤临床病理因素的关系。结果大肠癌患者及健康者粪便中广泛甲基化、部分甲基化及无甲基化分别为59.6%(31/52)、84.6%(44/52)、15.4%(8/52)和12.5%(4/32)，25.0%(8/32)、75.0%(24/32)；广泛和部分SFRP2的甲基化率在大肠癌患者粪便的检出率均明显高于健康体检者(P<0.05)；SFRP2基因甲基化与大肠癌患者性别、肿瘤分期、浸润程度无显著关联。结论SFRP2基因甲基化是大肠癌进展过程中的早期事件，粪便SFRP2基因甲基化有望成为早期无创诊断大肠癌的新途径。

关键词〔〕分泌型卷曲相关蛋白2；基因甲基化；大肠癌

中图分类号〔〕R735〔文献标识码〕A〔

基金项目：中国煤炭工业协会2012年度科学技术研究指导性计划项目(No.MTKJ 2012-420)

通讯作者：孙冬生(1963-)，男，主治医师，主要从事肿瘤内科方面的研究。

1普外科2肝胆外科

第一作者：贾凤洁(1972-)，女，主治医师，主要从事肿瘤与基因甲基化关系的方面的研究。

大肠癌的早期诊断有助于提高患者生存率及生活质量，但发病机制尚不清楚。新进研究发现，表观遗传学改变和突变在大肠癌的发生发展过程中起着重要的作用，相关基因尤其是抑癌基因、凋亡相关基因、DNA修复基因等启动子发生甲基化可导致其表达沉默，并且这是大肠癌发生的早期事件〔1〕。DNA甲基化改变与肿瘤的发生发展关系密切，正常肠道黏膜每天有大量细胞更新脱落进入肠腔，随粪便排出体外。分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)2基因是一种新发现的肿瘤抑制基因，在大多数大肠癌中表现出过甲基化。检测粪便中结直肠相关基因的甲基化状态有望成为早期无创诊断大肠癌的新途径。

1材料与方法

1.1组织及粪便标本的收集 选取2011年12月至2013年12月我院经病理检查确诊的52例大肠癌病人。纳入标准〔2〕：(1)首次确诊病例；(2)收集标本前未治疗和操作性肠道检查；(3)无其他重要脏器，如心、肺、肾等的病变。排除标准：(1)并发其他肿瘤；(2)术前均接受化疗或放疗等治疗；(3)不支持或无法配合完成本研究患者。另选取同期32例结肠镜阴性的健康者为对照组。大肠癌患者男28例，女24例，年龄39～75〔平均(60.4±14.6)〕岁；对照组32例，男17例，女15例，年龄62～68〔平均(65±2.1)〕岁；两组年龄和性别差异无统计学意义(P>0.05)。所有研究对象的粪便标本均在术前或内镜检查前收集，收集后2 h内送至实验室，分装后置于-80℃冰箱保存。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2主要仪器德国Analytik JenaAG公司的flexcycler PCR仪；美国Bio-Rad公司 PowerPacTM Basic Power Supply型电泳仪；美国Bio-Rad公司Sub-Cell GT 电泳槽；加拿大carestream公司的Gel Logic 212 PRO型凝胶成像的分析系统；美国Thermo公司Ultro freeze 3410超低温冰箱；中国宁波永新光学股份有限公司NIB-100型显微镜；美国应用生物系统公司(ABI)，310测序仪等。

1.3主要试剂PCR扩增引物中各序列均由上海的英骏公司设计合成；琼脂糖产于美国的Promega公司；宝生物TEXPAT试剂盒；EZ DNA Methylation KitTM。亚硫酸盐(Sigma)、苯二酚(Hydroquinone，Sigma)、Buffer(Promega 公司)。

1.4方法

1.4.1粪便DNA提取(不需要精制)取1 mg粪便放入装有1.5 ml裂解液的2 ml离心管中(裂解液的制作：1 mol/L Tris 5 ml+0.5 mol/L EDTA 1 ml)，95℃加热10 min后充分震荡；5 000 r/min离心5 min(室温)；取上清液放入新的2 ml离心管中。

1.4.2改良的亚硫酸盐液体配制取1.8 g的亚硫酸盐(Sigma),放入50 ml离心管中；加入纯净水2 ml、12.5 mol/L的NaOH 100 μl及10 mmol/L 对苯二酚300 μl(Hydroquinone，Sigma)。充分震荡后微波炉加温，再次震荡使之完全溶解。

1.4.3改良的粪便DNA的亚硫酸盐处理浓度：粪便上清液200 μl + 上述2溶液150 μl(最终亚硫酸盐浓度2.63 mol/L);温度条件：95℃ 15 min, 4℃ 10 min,75℃ 60 min。

1.4.4脱硫处理使用EZ DNA MethylationTM Kit。取350 μl的M-Binging Buffer，放入经过上述处理后的溶液中，混匀后放入Zymo-Spin IC Column中500 r/min离心5 min(室温)；加入M-Desulphonation Buffer 200 μl, 500 r/min离心5 min(室温)；此操作充分两次；最后加入纯净水40 μl,室温放置10 min后离心，作为PCR增扩时DNA模板使用。甲基化引物(荧光标记):SFRP2区域1正义:GTYGGAGTTTTTYGGAGTTG，反义：AACCCRCTCTCTTCRCTAAATAC，荧光标记NED，产物长度139 bp，酶切后长度：139、118、116，Hhal 37℃，12 h；区域2正义:GGTTGTTAGTTTTTYGGGGTTT，荧光标记 PET；反义:CAACIAACCAAAACCCTACAACAT，产物长度：153 bp，酶切后长度：120 bp，Hhal 37℃，12 h。PCR反应：Hot Start Taq Master Mix 12 μl，上下游引物各0.4 μmol/L，DNA模板4 μl，加水至24 μl。

1.5统计学方法应用SPSS13.0软件行χ2检验。

2结果

2.1经酶切后310测序仪电泳结果经酶切后310测序仪电泳结果见图1和图2所示，大肠癌患者粪便SFRP2基因广泛甲基化，健康人群粪便SFRP2基因无广泛甲基化。

图1　大肠癌患者粪便SFRP2基因广泛甲基化

图2　健康人群粪便SFRP2基因无广泛甲基化

2.2两组研究对象粪便标本甲基化情况比较大肠癌患者及健康者粪便中广泛甲基化、部分甲基化及无甲基化分别为59.6%(31/52)、84.6%(44/52)、15.4%(8/52)和12.5%(4/32)、25.0%(8/32)、75.0%(24/32)；广泛和部分SFRP2甲基化在大肠癌患者粪便的检出率均明显高于健康体检者(均P<0.05)。

2.3大肠癌患者临床特征与重亚硫酸盐限制性内切酶(COBRA)法检测粪便SFRP2基因阳性率的关系COBRA检测粪便结果与大肠癌患者性别、年龄、肿瘤分期等无显著关联(均P>0.05)。见表1。

表1SFRP2基因与大肠癌临床特征的关系〔n(%)〕

临床特征nSFRP2基因阳性χ2值P值性别 男2825(89.3)1.0170.313 女2419(79.1)TNM分期 Ⅰ/Ⅱ2521(84.0)0.0140.906 Ⅲ/Ⅳ2723(85.2)浸润程度 黏膜下层2017(85.0)0.0040.952 >肌层3227(84.4)

3讨论

大肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，近年来，随着经济的发展，我国人民生活水平的提高，其发病率呈现逐年升高的趋势，因此大肠癌预防的意义越来越重要〔3〕。由于癌瘤生长速度缓慢，在其达到产生症状、体征之前要经过相当长的时间，故临床前来就诊的患者往往癌肿已到晚期〔4〕。因此，早期诊断是提高大肠癌患者生存率及生活质量的关键。

DNA的异常甲基化可为非侵袭性检测结大肠癌提供一种新的策略，通过对无症状人群进行筛查或对有大肠癌家族史或确诊有癌前病变的患者进行监测是发现早期癌的重要途径〔5〕。目前传统确诊大肠癌的常规方法有纤维结肠镜检查和病理活检等，但上述方法要求患者禁食、导泻等肠道准备，且检查过程痛苦而繁琐以及需要花费病人较长的工作及休息时间等因素而不易被患者接受。近年来用于初筛的便潜血试验因为易受多种因素的影响而出现假阳性和假阴性，特异性差。故寻找更为敏感特异、简便、无创、安全的检测手段已成为大肠癌防治的重要课题之一。粪便DNA检测由于具备上述诸多优势，已成为近年来欧美等国大肠癌检测研究的热点〔6〕。最近研究显示，表观遗传学改变特别是DNA甲基化和突变在大肠癌的发生发展过程(结肠息肉、进展型腺瘤和大肠癌)中起着重要的作用，DNA甲基化变化被认为是结直肠癌发生的一个关键机制。人类有五种SFRP基因，其中SFRP2作为Wnt信号调控基因，涉及肿瘤的发生和进展。据目前多名学者研究指出SFRP2基因是肿瘤发生通路——Wnt信号通路的可溶性调整基因之一，在大肠癌、结肠腺瘤和隐窝病灶中发生频繁的甲基化，通过基化而使基因沉默的存在是大肠癌一个重要特征〔7〕。据报道〔8,9〕，正常肠道黏膜每天都会有大量细胞更新脱落进入肠腔，通过粪便排出体外。而大肠癌细胞增殖代谢更较正常肠道黏膜细胞旺盛，只要采取适当的方法将粪便中DNA提取出来，经过PCR扩增相关突变基因，再通过适当的方法对扩增产物进行分析，粪便中来自胃肠道肿瘤的所有遗传和后生变化的脱落细胞都能被检测出来，恶化前的腺瘤和大肠癌都可能通过这种方法检测,故分析粪便本研究说明粪便中甲基化的SFRP2基因是筛选大肠癌及癌前病变的一个很有前景的敏感的标志。

综上所述，粪便甲基化检测有望成为大肠癌早期无创诊断或高风险人群筛选的一个新途径。

4参考文献

1Mikeska T,Bock C,Do H,etal.DNA methylation biomarkers in cancer:progress towards clinical implementation〔J〕.Expert Rev Mol Diagn,2012;12(5):473-87.

2肖著军,王新颖,李丙生,等.联合检测vimentin和SFRP2甲基化在大肠癌筛查中的应用评价〔J〕.现代消化及介入诊疗,2014;19(1):13-6,20.

3朱其勇,吴可,黄海宁,等.T3期大肠癌患者新辅助化疗与手术前后外周血T细胞亚群变化的研究〔J〕.现代生物医学进展,2013;13(12):2261-4.

4江陈,常家聪.大肠癌的治疗方法研究进展〔J〕.安徽医药,2012;16(2):247-9.

5张丽静,孟丽敏,樊智彬,等.大肠癌患者血浆miR-106a的表达及意义〔J〕.南方医科大学学报,2014;34(3):354-7.

6Miller S,Steele S.Novel molecular screening approaches in colorectal cancer 〔J〕.J Surg Oncol,2012;105(5):459-67.

7汤东,薛彦俊,傅文杰,等.检测粪便中SFRP2基因超甲基化对筛查结直肠癌的意义〔J〕.武警医学,2009;20(10):873-6.

8徐梅华,蔡克银,涂颖,等.粪便基因甲基化分析对大肠癌的早期诊断价值〔J〕.临床消化病杂志,2012;24(1):17-9.

9肖著军,王新颖,李丙生,等.联合检测vimentin和SFRP2甲基化在大肠癌筛查中的应用评价〔J〕.现代消化及介入诊疗,2014;19(1):13-16,20.

〔2013-12-09修回〕

(编辑袁左鸣)