膜型基质金属蛋白酶1在胶质瘤及瘤旁组织中的表达及临床意义

膜型基质金属蛋白酶1在胶质瘤及瘤旁组织中的表达及临床意义

付胜伟岳树源

(天津医科大学总医院神经外科，天津300480)

摘要〔〕目的探讨膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)在胶质瘤及瘤旁组织中的表达及临床意义。方法选择54例胶质瘤标本及瘤旁相对正常脑组织，应用Western印迹实验及RT-PCR检测MT1-MMP的表达情况，并与临床相关特征进行关联分析。结果Western印迹结果显示MT1-MMP在不同级别胶质瘤中表达具有差异性，胶质瘤级别越高其条带灰度值越高，胶质瘤级别越低表达越弱。RT-PCR结果显示MT1-MMP mRNA的表达呈现出与Western印迹结果一致的趋势，正常脑组织、Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤与Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤之间表达具有统计学差异(P<0.05)，而Ⅲ级与Ⅳ级胶质瘤之间无明显差异性，并且MT1-MMP表达与患者生存期呈明显的负相关性。结论MT1-MMP的表达与胶质瘤级别相关，有可能是一个潜在的胶质瘤基因靶向治疗的位点。

关键词〔〕膜型基质金属蛋白酶1；胶质瘤；癌旁组织

中图分类号〔〕R73〔文献标识码〕A〔

通讯作者：岳树源(1962-)，男，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事脑肿瘤、脑血管病的手术治疗研究。

第一作者：付胜伟(1978-)，男，主治医师，在读硕士，主要从事脑外伤、脑出血的诊断和治疗研究。

胶质瘤是最常见的颅内原发肿瘤，预后差，致残率及致死率均很高〔1〕。胶质瘤发病原因尚不明确，目前认为可能与先天遗传易感性、后天环境因素以及电离辐射相关。基质金属蛋白酶(MMPs)被认为与多种恶性肿瘤的发生和浸润有关〔2〕， 膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)是MMPs家族中最重要的成员之一，被认为与肿瘤的增殖、凋亡、浸润、转移以及血管形成等密切相关〔3〕。本研究对原发胶质瘤以及瘤旁相对正常脑组织MT1-MMP水平进行检测，分析其与临床相关特征的关联。

1资料与方法

1.1一般资料收集天津医科大学总医院2009年1月至2010年12月行胶质瘤手术切除的病例54例，对其病历资料进行整理，并且在手术室收集部分胶质瘤标本及瘤旁2 cm外相对正常脑组织标本。术后经病理证实为原发性胶质瘤，其中Ⅰ级4例，Ⅱ级10例，Ⅲ级17例，Ⅳ级23例；男31例，女23例，年龄56～71〔平均(68.9±12.4)〕岁。手术标本均为新鲜标本，在手术过程中由术者在显微镜下确认为胶质瘤或脑组织标本后取下，迅速置于液氮中保存。纳入及排除标准：①患者为首次行胶质瘤切除术；②术后均坚持完成放疗、化疗等系统性治疗，放疗为全脑照射+术区照射相结合，化疗药物为泰道(替莫唑胺)；③无身体其他部位肿瘤，无其他严重慢性疾病；④无血液系统的疾病及其他免疫性疾病。

1.2Western印迹蛋白提取：将冻存于液氮的组织标本取出后，迅速研磨成粉末，并加入蛋白酶抑制剂及蛋白裂解液，冰上放置5 min后，12 000 r/min离心15 min，弃去下层沉淀，上清中加入5倍缓冲液煮沸5 min，行蛋白定量。一抗：单克隆抗膜型基质金属蛋白酶抗体(美国ebioscience公司)，二抗：山羊抗小鼠(中杉金桥生物科技公司)。配制10%的下层胶，5%上层胶，注入样品后，以80 V恒定电压进行样品压缩，待样品进入分离胶后，加电压120 V，至跑出所需要的条带止，进行转膜，350 mA恒定电流，约120 min。BSA封闭2 h，加入一抗过夜，次日加入二抗，洗脱，显色。

1.3RT-PCRRNA提取：胶质瘤及癌旁正常脑组织50～100 mg研成粉末，应用Trizol 抽打匀浆，加入0.2 ml氯仿剧烈震荡后，静置离心15 min取上层水相，进一步加入异丙醇沉淀水相中的RNA，DEPC处理水溶解RNA保存在液氮或低温冰箱。分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度。

逆转录：在20 μl体系中，加入1 μg总RNA,1 μl oligo dT12～18(500 μg/ml)。RNase-Free水，70℃温育10 min后立即冰浴冷却，继续加入4 μl 5倍缓冲液,2 μl 0.1 mol/L DTT,1 μl 10 mol/L dNTPs (10 mol/L/种)，混匀后于42℃保温2 min，加入1 μl(200 U)的反转录酶，42℃继续温育50 min。70℃15 min灭活反转录酶。mRNA反转录成cDNA后-20℃储存。PCR：建立PCR反应体系，由上海康城生物技术公司提供PCR引物合成，引物序列：3′-5′:CATCCATGAGAACTATGGTATC,5′-3′:CCCCAAAAAGTTCCTGGATG。反应条件为94℃ 2 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min 为第一步1个循环； 94℃ 45 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min 为第二步30个循环；72℃ 10 min延伸。应用RT-PCR仪自带分析软件，产生PCR扩增曲线。

2结果

2.1Western印迹结果MT1-MMP在不同级别胶质瘤中表达具有一定的差异性，胶质瘤级别越高其条带灰度值越高，胶质瘤级别越低表达越弱，而在相对正常脑组织中表达最低(图1)。

图1　各组MT1-MMP表达的Western印迹结果

2.2RT-PCRMT1-MMP mRNA的表达呈现出与Western印迹结果一致的趋势，脑组织(0.681±0.203)、Ⅰ级(1.158±0.539)、Ⅱ级(1.130±0.555)胶质瘤与Ⅲ级(1.710±0.793)、Ⅳ级(1.849±0.690)胶质瘤之间mT1-MMP表达具有统计学差异(P<0.05)，而Ⅲ级与Ⅳ级胶质瘤之间无明显差异性。

2.3MT1-MMP表达水平与胶质瘤临床特征的关系对所有患者进行跟踪随访直至死亡，未死亡的病例随访至2年。对患者性别、年龄、肿瘤复发情况、生存期等临床特点与MT1-MMP表达情况进行相关性分析，结果性别、年龄等与患者MT1-MMP表达情况无相关性，而肿瘤级别与MM1-MMP表达呈正相关，生存期与MT1-MMP表达呈负相关性。见表1。

表1MT1-MMP表达情况与临床特征的相关性〔n(%)〕

指标nMT1-MMP高表达P值性别 男3121(66.6)0.9021 女2317(68.2)年龄(岁) ≤603625(70.27)0.7015 >601813(66.66)肿瘤级别 Ⅰ40(0)0.0201 Ⅱ103(30.00) Ⅲ178(47.05) Ⅳ2317(73.91)生存期(个月) ≤62815(61.80)0.0391 >62623(90.47)

3讨论

胶质瘤多呈浸润性生长、边界不清，往往伴有坏死、出血等病理形态，是致死率最高的恶性肿瘤之一。目前临床上针对胶质瘤的治疗主要是“手术+放疗+化疗”的系统治疗方案，但由于胶质瘤边界不清，多生长在重要的脑功能区，所以手术常很难完全切除，而其对放疗敏感性较差，同时由于血脑屏障的限制，化疗药物作用有限，因此胶质瘤预后较差，特别是胶质母细胞瘤，多数患者生存期仅数月到1年。胶质瘤的基因靶向治疗是近年来兴起的治疗方式，杨学军等〔4〕对胶质瘤基因治疗做了大量的研究，在体外实验中取得了一定的成果。

MT1-MMP是膜型MMPs家族中的成员之一，主要参与细胞外基质的降解和激活MMPs家族另外的多种金属基质蛋白酶，对肿瘤的侵袭、扩散、细胞增殖及肿瘤新生血管的形成都具有直接的诱导和促进作用。MT1-MMP可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，破坏肿瘤扩散转移的重要生理屏障。文献〔5〕报道MT1-MMP可以通过与不同的细胞因子相互作用而加快肿瘤细胞的迁移，而Udayakumar等〔6〕报道MT1-MMP可以通过上调血管内皮细胞生长因子，诱导碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、肝细胞生长因子等表达，从而促进肿瘤血管的生成。而事实上MT1-MMP的表达同样受到多种因素的调节，Lee等〔7〕报道金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)是MT1-MMP的天然内源性抑制因子，通过调低TIMP后肿瘤细胞系的生长受到明显抑制。

徐涛等〔8〕检测123例肝癌组织，依据肿瘤进展程度将其分为浸润组和非浸润组，结果显示MT1-MMP在浸润组的表达明显高于对照组，并且浸润组中伴有血清VEGF 的升高和肿瘤血管的增加。苗杰〔9〕则探讨了胃癌组织中CD147、MT1-MMP表达情况，结果显示胃癌组织中MT1-MMP、CD147表达明显高于正常胃黏膜组织，且与分化程度、转移程度、淋巴结转移等密切相关；CD147蛋白表达与MT1-MMP呈正相关(r=0.467，P<0.01)。MT1-MMP在胶质瘤中的表达也有相关报道〔10〕，其结果与本文基本相似，但未作出临床特征关联。姚广裕等〔11〕发现MT1-MMP可以通过激活MMP-2影响乳腺癌细胞株的浸润能力。

总之，笔者认为MT1-MMP对胶质瘤的发生、发展具有一定的影响和促进作用，但是胶质瘤的各种生物学行为受到多种基因的调控，MT1-MMP在胶质瘤生长中的具体作用目前尚不得而知，需要通过深入的基础研究进行探讨。但在本研究中MT1-MMP在高级别胶质瘤中表达明显增强，并且与生存期呈负相关，至少提示有可能将MT1-MMP作为一个潜在靶向基因治疗的位点，为胶质瘤的治疗提供一个新的方向。

4参考文献

1Satoru Kawarazaki, Kazuya Taniguchi, Mitsuaki Shirahata，etal.Conversion of a molecular classifier obtained by gene expression profiling into a classifier basedon real-time PCR: a prognosis predictor for gliomas〔J〕.BMC Med Genom,2010;3(52):1755-67. Kawarazaki, Kazuya Taniguchi, Mitsuaki Shirahata，etal.Conversion of a molecular classifier obtained by gene expression profiling into a classifier basedon real-time PCR: a prognosis predictor for gliomas〔J〕.BMC Med Genom,2010;3(52):1755-67.

2杨娜，朱运奎.膜型基质金属蛋白酶1与肿瘤的侵袭和转移的研究进展〔J〕.国际呼吸杂志，2010;30(16)：1021-3.

3Yu X, Zech T, McDonald L,etal.N-WASP coordinates the delivery and F-actin-mediated capture of MT1-MMP at invasive pseudopods〔J〕.J Cell Biol，2012；199(3):527-44.

4杨学军，浦佩玉.恶性胶质瘤基因治疗十年进展〔J〕.现代神经疾病杂志，2003；3(1)：73-4.

5Ross AC.All-Trans-retinoic acid and the glycolipid α-galactosylceramide combined reduce breast tumor growth and lung metastasis in a 4T1 murine breast tumor model〔J〕.Nutr Cancer,2012；64(8):1219-27.

6Udayakumar TS,Nagle RB,Bowden GT．Fibroblast growth factor-1 transcriptionally induces membrane type-1 matrix metalloproteinase expression in prostate carcinoma cell line〔J〕.Prostate，2004；58(3)：66-75.

7Lee MH，Atkinson S，Rapti M，etal.The activity of adesigner tissue inhibitor of metalloproteinases(TIMP)-1 against native membrane type 1 matrix metalloproteinase(MTl-MMP)in a cell-based environment〔J〕.Cancer Lett，2010；290：114-22.

8徐涛，李乐平，石玉龙，等.膜型基质金属蛋白酶1在浸润性肝细胞癌组织中的表达及意义〔J〕.中华实验外科杂志，2012;29(1)：80-2.

9苗杰.胃癌组织中的CD147、MT1-MMP表达及临床意义〔J〕.山东医药，2011;51(35)：52-3.

10Williams BB, Mundell N, Dunlap J,etal.The planar cell polarity protein VANGL2 coordinates remodeling of the extracellular matrix〔J〕.Commun Integr Biol,2012;5(4):325-8.

11姚广裕，曾木圣，林鹏，等.膜型基质金属蛋白酶1对乳腺癌细胞浸润能力的影响〔J〕.中华肿瘤杂志，2006;28(9)：650-3.

〔2013-07-11修回〕

(编辑徐杰)