九龙虫对衰老小鼠免疫功能的影响

九龙虫对衰老小鼠免疫功能的影响

周先云潘朝旺

(鄂州职业大学医学院药学系，湖北鄂州436000)

摘要〔〕目的观察九龙虫对D-半乳糖衰老模型小鼠免疫功能的影响。方法60只昆明小鼠随机分成6组，正常组、模型组、阳性对照组、高剂量、中剂量、低剂量九龙虫组。D-半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老的大鼠模型。42 d后，检测胸腺指数和脾脏指数，血清白介素(IL)-2、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量，脾脏淋巴细胞凋亡率、脾脏自然杀伤细胞(NK细胞)活性和腹腔吞噬细胞吞噬能力。结果与正常组比较，模型组胸腺指数、脾脏指数、血清IL-2、脾脏NK细胞杀伤力和腹腔吞噬细胞吞噬能力明显下降，血清IL-6、TNF-α、脾脏淋巴细胞凋亡率明显升高，各给药组的上述指标均得到改善。结论九龙虫抗衰老作用可能通过改善机体免疫功能而实现。

关键词〔〕九龙虫；衰老；免疫功能

中图分类号〔〕R285〔文献标识码〕A〔

基金项目：湖北省教育厅科学技术研究项目(B2013002)；鄂州职业大学校级科研项目(2013zd04)

第一作者：周先云(1967-)，女，副教授，主要从事药学研究。

九龙虫，别名“洋虫”，在《本草纲目拾遗》和《中药大辞典》均有记载，对多种疾病有良效〔1〕。在民间，九龙虫被广泛用着抗衰老保健食品，但对于九龙虫的抗衰老研究，尚未见报道。本实验旨在研究九龙虫对D-半乳糖衰老模型小鼠免疫功能的影响，探讨其延缓衰老机制。

1材料与仪器

1.1动物昆明种小鼠60只，体重(20±2)g，雌雄各半，清洁级，合格证号：医动字-042，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

1.2药品与试剂D-半乳糖(20120213)，上海喜润化学工业有限公司；九龙虫散，本院自制，用前配成混悬液；灵芝多糖(20120422)，浙江益圣菌物发展有限公司；白介素(IL)-2 测定试剂盒(20120625)，IL-6测定试剂盒(20120614)，肿瘤坏死因子(TNF)-α测定试剂盒(20120526)，购于上海抚生实业有限公司；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(20120509)，天津百浩生物科技有限公司。

1.3仪器9602A酶标仪，南京普朗医用设备有限公司；台式冷冻离心机，上海安亭科学仪器公司；COULTEREPICSXL流式细胞仪，美国；PT-MR3100D组织匀浆机,瑞士Polytron公司。

1.4方法

1.4.1动物造模及分组给药取小鼠60只，随机分为6组：分别为正常组、模型组、阳性对照组、高剂量、中剂量、低剂量九龙虫组。除正常组外，其余各组每日颈背皮下注射半乳糖120 mg/kg，连续42 d，致亚急性衰老模型，正常组注射等量生理盐水。造模同时分别灌胃给予高、中、低剂量九龙虫混悬液0.028、0.014、0.007 g·kg-1·d-1，阳性对照组给予灵芝多糖0.1 g·kg-1·d-1，正常组及模型组给予生理盐水15 ml·kg-1·d-1。末次给药24 h后，称重，进行相应指标检测。

1.4.2血清IL-2、IL-6、TNF-α的测定将小鼠摘除眼球取血，离心，制备血清，按试剂盒说明测定血清中IL-2 、IL-6、TNF-α含量。

1.4.3胸腺指数和脾脏指数的测定小鼠取血后断颈处死，立即取胸腺和脾脏称重，计算脏器指数。脏器指数=脏器重量(g)/体重(g)。

1.4.4脾脏淋巴细胞凋亡检测脾脏称重后立即剥离干净，生理盐水冲洗，取一半(另一半用于NK细胞活性测定)研磨过100目筛(加磷酸盐缓冲液)，离心1 000 r/min 10 min，弃上清液，加红细胞裂解液适量，混匀，静置5～6 min，待红细胞完全破碎，离心1 000 r/min 10min，弃上清液去除红细胞，用加入10%胎牛血清的1640完全培养液重悬细胞，调整细胞浓度2×106个/ml，取上述液体0.1 ml按ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测分析。

1.4.5脾脏NK细胞活性的检测取另一半脾脏，按照文献〔2〕的方法测定NK细胞活性，以杀伤力(%)表示。

1.4.6腹腔巨噬细胞吞噬功能的检测小鼠取脾脏后，按照文献〔3〕的方法提取腹腔巨噬细胞，中性红实验检测吞噬能力。

1.5统计学处理数据用SPSS13.0软件进行t检验。

2结果

2.1对小鼠血清IL-2、IL-6、TNF-α的影响与正常组比较，模型组小鼠血清IL-2含量降低，IL-6和TNF-α含量升高(P<0.01)；阳性对照组和九龙虫各剂量组与模型组相比，血清IL-2升高，IL-6和TNF-α含量降低(P<0.05或P<0.01)。见表1。

组别IL-2(ng/ml)IL-6(pg/ml)TNF-α(pg/ml)正常组8.54±1.562)129.32±11.652)5.06±0.422)模型组5.98±1.13162.46±15.286.83±0.51阳性对照组7.88±1.212)137.34±15.372)5.66±0.432)高剂量九龙虫组8.04±1.372)138.48±13.242)5.43±0.482)中剂量九龙虫组7.26±1.352)143.87±11.072)5.61±0.522)低剂量九龙虫组7.32±1.392)145.46±11.832)6.32±0.551)

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.2对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响与正常组比较，模型组小鼠胸腺指数和脾脏指数降低(P<0.01)；阳性对照组和九龙虫各剂量组与模型组相比，胸腺指数和脾脏指数升高(P<0.05或P<0.01)。见表2。

组别胸腺(g/g)脾脏(g/g)正常组0.426±0.0942)0.572±0.0822)模型组0.325±0.0750.443±0.065阳性对照组0.393±0.0812)0.551±0.0752)高剂量九龙虫组0.412±0.0802)0.564±0.0712)中剂量九龙虫组0.382±0.0792)0.502±0.0732)低剂量九龙虫组0.379±0.0762)0.480±0.0791)

2.3对小鼠脾脏淋巴细胞凋亡的影响与正常组比较，模型组小鼠脾脏淋巴细胞凋亡率升高(P<0.01)；阳性对照组和九龙虫各剂量组与模型组相比，淋巴细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。见表3。

2.4对小鼠脾脏NK细胞活性的影响与正常组比较，模型组小鼠脾脏NK细胞杀伤力降低(P<0.01)；与模型组相比，阳性对照组和高剂量九龙虫组NK细胞杀伤力显著升高(P<0.01)，高剂量九龙虫组明显升高(P<0.05)，低剂量九龙虫组也有所升高，但无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.5对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响与正常组比较，模型组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力降低(P<0.01)；阳性对照组和九龙虫各剂量组与模型组相比，巨噬细胞吞噬能力显著升高(P<0.01)。见表3。

组别脾淋巴细胞凋亡率(%)脾NK细胞杀伤力(%)腹腔巨噬细胞吞噬能力(A值)正常组18.35±3.592)56.39±6.832)0.66±0.0542)模型组26.44±3.8741.20±5.310.43±0.038阳性对照组21.62±2.982)51.87±5.952)0.58±0.0672)高剂量九龙虫组20.97±3.212)52.69±6.422)0.60±0.0482)中剂量九龙虫组22.58±2.842)46.64±5.271)0.55±0.0522)低剂量九龙虫组21.63±3.052)43.29±6.080.51±0.0452)

3讨论

胸腺是机体的中枢免疫器官，有报道〔4〕认为，胸腺衰老在免疫衰老过程中起主导作用，胸腺的衰老受胸腺内环境、细胞凋亡及神经内分泌等的调控，在这些因素的影响下，胸腺功能发生变化，胸腺衰老可影响机体细胞免疫和体液免疫导致继发性免疫缺陷。脾脏是人体最大的外周免疫器官,它的功能与机体特异性免疫和非特异性免疫密切相关。本实验显示衰老时胸腺和脾脏都出现萎缩。

IL-2、IL-6在衰老机体免疫功能或紊乱的发生过程中起着重要作用。IL-2具有促进T细胞增殖分化，增强NK细胞、T细胞活性，诱导干扰素生成的作用，是重要的免疫增强因子，其水平降低是免疫衰老的重要分子机制，IL-2与衰老的关系，已经受到关注〔5〕。IL-6作为一种主要的免疫调节物,其水平异常升高可使机体出现炎症反应；导致免疫和神经内分泌功能紊乱；促进动脉粥样硬化等作用，是机体免疫衰老的一个重要原因〔6〕。TNF-α作为一种多功能细胞因子，在炎性衰老中起着重要作用，其浓度随着大鼠月龄的增加而升高〔7〕，因此可以作为分析衰老程度的指标之一。随着大鼠月龄的增加，淋巴细胞的凋亡率逐渐升高〔8〕，健康老年人比健康成年人外周血淋巴细胞的凋亡率明显增高〔9〕。NK细胞和巨噬细胞反映了机体的细胞免疫状态，机体衰老时它们的杀伤力和吞噬能力下降〔10〕。

本实验显示，九龙虫对衰老模型小鼠免疫功能有明显影响，可抑制衰老小鼠胸腺和脾脏的萎缩；升高血清IL-2含量，降低IL-6、TNF-α含量；抑制淋巴细胞凋亡，增强NK细胞、巨噬细胞功能，通过这些因素而发挥延缓衰老的作用。

4参考文献

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9王晓莲，周苏明，周静，等.老年人外周血淋巴细胞的凋亡及CD28和CD95的表达〔J〕.中华老年多器官疾病杂志，2009；2(8)：27-30.

10桂琳，葛飞，董群，等.细脚拟青霉提取物对D-半乳糖致衰小鼠免疫功能的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(13)：2467-9.

〔2013-05-27修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)