左归降糖清肝方含药血清对脂肪酸孵育的HepG2细胞脂肪变性的影响

左归降糖清肝方含药血清对脂肪酸孵育的HepG2细胞脂肪变性的影响

成细华喻嵘胡伟1唐元2罗文娟2曾辛程莉娟

(湖南中医药大学，湖南长沙410208)

摘要〔〕目的探讨左归降糖清肝方含药血清对脂肪酸孵育的人肝细胞株(HepG2)细胞内甘油三酯(TG)含量的影响。方法用混合脂肪酸孵育的HepG 2 细胞建立细胞脂肪变性模型；将实验分为正常组，模型组，5%、10%、15%含药血清组，油红O染色法检测细胞内脂质沉积，同时定量检测细胞内TG含量。结果0.5 mmol/L 混合脂肪酸孵育HepG2细胞24 h，可诱导细胞内TG大量沉积，而10%、15% 左归降糖清肝方含药血清可抑制脂肪酸这一效应，使细胞内TG含量明显下降(P<0.01)。结论左归降糖清肝方含药血清可改善脂肪酸诱导的HepG2细胞脂肪变性。

关键词〔〕左归降糖清肝方；HepG2细胞；脂肪变性；甘油三酯

中图分类号〔〕R285.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金(81102593，81273753);地方高校国家级大学生创新创业训练计划(No.201210541003);中西医结合基础湖南省重点学科资助

通讯作者：程莉娟(1979-)，女，副教授，主要从事中医药防治糖尿病机制的研究。

1湖南省工伤康复中心2湖南中医药大学2012级研究生

第一作者：成细华(1974-)， 女，博士，教授，硕士生导师，主要从事中医药防治糖尿病机制的研究。

Effect of Zuogui Jiangtang Qinggan Recipe on steatosis in HepG2 cells induced by fatty acid

CHENG Xi-Hua, YU Rong,HU Wei,etal.

Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, Hunan, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of Zuogui Jiangtang Qinggan Recipe (ZJQR) on triglyceride(TG) accumulation in HepG2 cells induced by fatty acid mixed.MethodsThe cell model of steatosis was established by fatty acid mixed in HepG2 cells. The experiments were divided into control, model, 5%, 10%, 15% medicated serum groups. The amount of TG in HepG2 cells was quantitatively analyzed by oil red O staining method.ResultsThe fatty acid mixed (0.5 mmol/L) resulted in significant steatosis in HepG2 cells. The 10%, 15% medicated serum inhibited the effect of the fatty acid mixed, and significantly reduced the intracellular TG content.ConclusionsZJQR is able to ameliorate the excessive TG accumulation in HepG2 cells induced by fatty acid mixed.

【Key words】Zuogui Jiangtang Qinggan Recipe(ZJQR); HepG2 cells;Steatosis;Triglyceride

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)为肝病领域的主要热点〔1〕。左归降糖清肝方具有滋阴益气、活血解毒之功效。前期研究表明，其能有效改善高脂饮食转基因2型糖尿病双受体功能缺损(MKR)鼠空腹血糖、血脂、肝功能指标、肝质量和肝指数，改善肝脏脂肪性变〔2〕。本文采用体外细胞培养技术结合中药血清药理学方法，以混合脂肪酸诱导人肝细胞株HepG2细胞脂肪变性模拟NAFLD形成，观察左归降糖清肝方对脂肪酸孵育的HepG2细胞甘油三酯(TG)含量的影响，从体外进一步揭示左归降糖清肝方的降脂作用。

1材料与方法

1.1细胞株和实验动物HepG2细胞株购自中南大学湘雅医学院细胞库。清洁级SD大鼠，动物合格证号：SYXK(湘)2009-0001，体重250～300 g，雌雄不拘，由湖南中医药大学实验动物中心提供，饲养在湖南中医药大学SPF级实验动物中心，用于制备含药血清。

1.2药物左归降糖清肝方中药购自湖南中医药大学杏林药号。煎2次，合并煎液，过滤浓缩至生药1 g/ml，4℃冰箱贮存备用。

1.3主要试剂DMEM培养基(Gibco，美国)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，0.25% 胰蛋白酶(Gibco，美国)，油酸、棕榈酸(Sigma，美国)，TG试剂盒(南京建成生物工程研究所，F001-1)。

1.4左归降糖清肝方含药血清的制备40只SD大鼠随机分为两组，每组20只。左归降糖清肝方按临床体表面积换算，以生药59.28 g/kg，2次/d灌胃，连续7 d；对照组给予等体积蒸馏水。第7天给药后1 h，腹主动脉插管采血，室温静置1 h，3 000 r/min离心15 min，取上清，56℃灭活30 min，0.22 μm滤膜过滤灭菌，-20℃保存备用。使用前用DMEM培养基稀释成体积分数含药血清。

1.5浓度血清制备胎牛血清组为15%胎牛血清DMEM；正常组为15%正常大鼠血清DMEM；5%、10%、15%含药血清组为终浓度5%、10%、15% 含药血清，血清浓度不足用无药血清补至15%。

1.6细胞培养与传代HepG2细胞用培养液(DMEM培养液+15% 胎牛血清+青霉素 100 U/ml，链霉素0.1 mg/ml)在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，24 h更换培养液，细胞约80%～90% 融合度时，用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞并传代。

1.7噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度含药血清对HepG2细胞活力的影响HepG2细胞分为胎牛血清组，无药血清组和5%、10%、15%含药血清组。15%DMEM培养HepG2细胞12 h，待细胞贴壁后，更换培养液。每组设6个复孔，培养24 h后，用 MTT法测定细胞存活率。酶联免疫检测仪测定光吸收值(波长490 nm)。左归降糖清肝方含药血清对HepG2细胞存活率=OD含药血清/OD无药血清×100%。

1.8肝细胞脂肪变性模型建立HepG细胞用含0.5 mmol/L混合脂肪酸(OA∶PA=2∶1)血清培养液培养12、24、36 h。

1.9分组及干预将细胞分为正常组，模型组，5%、10%、15%含药血清组。培养HepG2细胞12 h，待细胞贴壁后，更换相应培养液。模型组，5%、10%、15% 含药血清组同时加混合脂肪酸至终浓度0.5 mmol/L。细胞培养24 h 后，进行相关指标检测。

1.10细胞内脂滴变化检测细胞接种于盖玻片上，待实验结束后，吸弃培养孔中的培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3遍，4% 多聚甲醛固定10 min，风干细胞爬片。PBS洗爬片2次，3 min/次；油红O染液闭光染色20 min；60%异丙醇冲洗30 s；苏木精细胞核复染；蒸馏水洗30 s至背景透明，甘油封片，将爬片置于显微镜下拍照。

1.11细胞内TG水平测定胰蛋白酶消化，1 000r/min离心5 min收集细胞；加入500 μl异丙醇冰上静置抽提2 h，-4℃，16 000 r/min离心10 min。取上清真空抽干，用20 μl异丙醇溶解，按试剂盒说明测定TG含量，二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白含量。结果表示为每克细胞总蛋白中所含的TG量(mg/g)。

2结果

2.1左归降糖清肝方含药血清对HepG2细胞活力的影响以15%无药血清DMEM或15%胎牛血清的DMEM培养HepG2细胞，细胞生长及形态均正常。15%无药血清组OD490为0.342±0.031，存活率100%；15%胎牛血清组OD490为0.352±0.022，存活率102.9%，两者比较无明显差异(P>0.05)。5%、10%、15%、20%含药血清OD490为0.334±0.010,0.329±0.025,0.334±0.027,0.252±0.012。与无药血清组比较，5%、10%和15%含药血清组HepG2细胞存活率(97.7%，96.3%，97.7%)没有明显变化(P>0.05)，而20%含药血清细胞存活率(73.7%)下降(P<0.01)。

2.2培养时间对HepG2细胞脂质堆积的影响油红O染色，将细胞内出现的脂滴沉积染成红色，细胞内红色显影出现比例越高，提示细胞内脂滴沉积越多。0.5 mmol/L混合脂肪酸(OA∶PA=2∶1)培养HepG2细胞12、24、36 h后，细胞内脂滴脂滴含量呈时间依赖性增加。相同时间点与正常培养HepG2细胞比较，脂滴堆积明显增加。见图1。

2.3左归降糖清肝方对HepG2细胞脂质堆积的影响模型组HepG2细胞经油酸诱导24 h后，与正常组比较，细胞内出现了大量的脂滴沉积，5%、10%和15%含药血清处理细胞后，细胞内的脂滴呈剂量依赖性减少。见图2。

图1　混合脂肪酸诱导对HepG2细胞脂质堆积的影响(油红O染色，×250)

图2　左归降糖清肝方对HepG2细胞脂质堆积的影响(油红O染色，×250)

2.4左归降糖清肝方对HepG2细胞内TG含量的影响左归降糖清肝方均能降低脂肪酸诱导的HepG2细胞内TG含量。与模型组〔(275.3±11.6)mg/g〕比较，10%和15%含药血清处理的HepG2细胞内TG含量〔(224±16.7)、(213±11.2)mg/g〕降低(P<0.01)。正常组TG含量(185±13.1)mg/g,5%含药血清能降低HepG2细胞内TG含量〔(250.1±23.8)mg/g〕，但与模型组比较无统计学意义(P>0.05)。

3讨论

NAFLD的治疗缺乏特效药物，治疗重点在于消除或控制与相关的因素，如糖尿病、高血脂、肥胖等。主要措施包括控制饮食，适度运动，改变不良行为、减肥、积极控制糖尿病和高脂血症等，但是采用药物干预抑制脂肪肝的发生、发展也是目前面临的任务，而中医药在治疗NAFLD方面显示了较好的优势〔3,4〕。

根据滋阴益气活血化瘀法组方的左归降糖清肝方，在临床治疗糖尿病合并脂肪肝有明显疗效，在餐后2 h血糖、血脂、肝功能、肝脏彩超及总体疗效方面明显优于对照组〔5〕。在动物实验方面，其能减轻高脂饮食加剧的MKR小鼠的胰岛素抵抗(IR)，降低血糖、血脂水平，其机制与调节肝脏内质网应缴(ERS)，从而进一步调节肝脏脂质代谢密切相关〔2,6,7〕。本实验中，15% 左归降糖清肝方含药血清可干预混合脂肪酸诱导的HepG2细胞中脂质沉积，减少TG含量。

综上所述，在接近NAFLD病理状态的体外模型中，证实了左归降糖清肝方对肝细胞脂肪变性有改善作用，但具体的分子机制尚不清楚，还有待进一步研究。

4参考文献

1Lewis JR，Mohanty SR.Nonalcoholic Fatty liver disease：a review and update〔J〕.Dig Dis Sci，2010；55(3)：560-78.

2吴勇军，成细华，喻嵘，等.左归降糖清肝方对2型糖尿病转基因MKR鼠脂肪肝发生的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2011；17(5)：140-3.

3胡爱民，晏玲.糖肝煎对糖尿病并脂肪肝大鼠肝功能及肝组织病理形态学的影响〔J〕.中西医结合研究，2010；2(5)：229-32.

4刘竞芳，郭淑琴，任慧雅，等.化浊导滞、活血化瘀法治疗肥胖型糖尿病性脂肪肝临床观察〔J〕.医学研究与教育，2010；27(5)：55-7.

5程莉娟，成细华，喻嵘，等.滋阴益气活血解毒法治疗32例2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的临床观察〔J〕.中华中医药杂志，2013；28(9)：2807-9.

6程莉娟，成细华，喻嵘，等.左归降糖清肝方对小鼠糖尿病合并脂肪肝脂代谢相关基因mRNA表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(17)：4182-4.

7成细华，程莉娟，张琴，等.滋阴益气活血解毒方对糖尿病合并脂肪肝小鼠SREBP-1c表达的影响〔J〕.北京中医药大学学报，2013；36(8)：534-7.

〔2013-12-17修回〕

(编辑袁左鸣)