Triple-TOF-MS/MS法检测植物油中甘油三酯

邢常瑞，袁翔宇，章 铖，鞠兴荣，袁 建，何 荣

(1.南京财经大学 食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量 安全控制及深加工重点实验室，南京 210023； 2.安徽粮食工程职业学院，合肥 523147)

天然植物油中含有复杂的甘油三酯组分，其在植物油中的含量高达95%～98%[1]。组成甘油三酯的脂肪酸种类及其在甘油骨架上的位置决定了甘油三酯特殊营养价值，因此研究甘油三酯的组成具有十分重要的意义。

目前，检测甘油三酯常用的方法主要有高温气相色谱法、高效液相色谱法等，其中高效液相色谱法尤其是反相高效液相色谱法的应用最为普遍。检测器有紫外、示差折光[2]、蒸发光散射[3]等常用来识别和表征甘油三酯，但是只能对有标准品且保留时间不同的甘油三酯进行定性定量区分、测定，对于碳原子当量(ECN)相同即保留时间相同的甘油三酯则无法鉴别。蒸发光散射检测器(ELSD)仅能对植物油中的甘油三酯进行初步的定性，确定基本的ECN轮廓。高分辨质谱(Triple-TOF-MS/MS)可进行未知物的探索，对没有标准品的物质也能根据其母离子及碎片离子推测其结构。

本文在高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法分析以ECN计的芝麻油、菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油和玉米油的甘油三酯组成与含量的基础上，采用高分辨质谱对6种食用植物油中的甘油三酯进行测定，并确定每种ECN下的甘油三酯组成与含量，建立一种分析测定食用植物油中甘油三酯组成与结构的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

芝麻油(采集自安徽主产区，3个)、菜籽油(采集自湖南主产区，包括1个低芥酸菜籽油和2个高芥酸菜籽油)、大豆油(采集自东北三省，3个)、花生油(市场选购，3个)、葵花籽油(市场选购，3个)和玉米油(市场选购，3个)；0.22 μm尼龙微孔滤膜(天津津腾公司)，乙腈(德国Merck公司，色谱级)，异丙醇(德国Merck公司，色谱级)。

BSA223S-CW电子天平；SB25-12DTDN超声波清洗器；Dionex Utimate3000液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)；Alltech3300蒸发光散射检测器(美国Grace公司)；Triple-TOF-MS/MS(美国AB Sciex公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的前处理

称取50 mg的植物油样溶解于乙腈-异丙醇(体积比1∶1)中[4]，并定容至10 mL容量瓶中，经0.22 μm尼龙微孔滤膜过滤后，置于2 mL进样瓶中，分别进行HPLC-ELSD检测和Triple-TOF-MS/MS检测。在进行Triple-TOF-MS/MS检测前，需要对过膜的样品稀释1 000倍。

1.2.2 HPLC-ELSD检测条件

色谱柱为Accucore C18反相柱(2.6 μm，4.6 mm×150 mm)；流动相为乙腈和异丙醇，进行梯度洗脱，洗脱程序见表1；流速0.8 mL/min；柱温30℃；进样量10 μL。ELSD参数：漂移管温度50℃，载气流速1.8 L/min，增益为1[5]。

表1 高效液相色谱流动相梯度洗脱程序

1.2.3 Triple-TOF-MS/MS检测条件

HPLC条件：色谱柱为Accucore C18反相柱(2.6 μm，4.6 mm×150 mm)；流动相为乙腈-水(体积比19∶1)和异丙醇，其中在乙腈-水中添加5 mmol/L乙酸铵[6]，进行梯度洗脱，洗脱程序见表2；流速0.6 mL/min；柱温30℃；进样量5 μL。

Triple-TOF-MS/MS条件：ESI正离子源，TOF-MS采集积累时间0.25 s，采集范围(m/z)100～1 200，离子源温度500℃，电喷雾电压5 000 V，雾化气压力310.26 kPa，辅助气压力344.75 kPa，气帘气压力241.32 kPa，碰撞气体为氮气，去簇电压80 V，碰撞能量35 V[7]。

表2 Triple-TOF-MS/MS梯度洗脱程序

1.2.4 甘油三酯定性分析

根据AOCS标准中大豆油甘油三酯标准色谱图进行比对，再结合甘油三酯在高效液相色谱中的出峰规律，即碳原子当量数(ECN)越大，保留时间越长，确定各个色谱峰对应的甘油三酯的ECN。

Triple-TOF-MS/MS根据甘油三酯分子中碳链在质谱中断裂规律，结合在质谱中获得一级质谱母离子(加氢母离子、加钠离子和加氨母离子)相对分子质量以及二级质谱的碎片离子([DAG]+)对各甘油三酯进行定性。

1.2.5 甘油三酯定量分析

利用面积归一化法计算各甘油三酯的相对含量，即甘油三酯相对含量=各甘油三酯峰面积/总峰面积×100%。

2 结果与讨论

2.1 HPLC-ELSD检测食用植物油甘油三酯组成

按照1.2.2高效液相色谱条件对食用植物油样品进行色谱分离，根据1.2.4初步定性后采用面积归一化法测定不同ECN下的甘油三酯相对含量，结果见表3。

表3 HPLC-ELSD测定的植物油不同ECN下甘油三酯相对含量

由表3可知，6种植物油的甘油三酯多集中在ECN为42～48之间。高芥酸菜籽油与低芥酸菜籽油不同ECN下的甘油三酯含量有很大差别，高芥酸菜籽油的甘油三酯组成更复杂，其中ECN为50以上的甘油三酯含量明显高于低芥酸菜籽油和其他5种植物油，花生油中C20以上的饱和脂肪酸如花生酸、山嵛酸、木焦油酸的含量都远高于其他5种植物油，因此花生油ECN为50的甘油三酯含量也较高。芝麻油与葵花籽油和玉米油在脂肪酸组成上较为相似，其ECN甘油三酯的组成与含量差异也不大。但是在同一保留时间的色谱峰包括多种具有相同ECN的不同种类的甘油三酯，HPLC-ELSD无法确定各个色谱峰相对应的甘油三酯，仅能对甘油三酯的ECN轮廓进行初步鉴定。

2.2 Triple-TOF-MS/MS检测食用植物油甘油三酯组成

按照1.2.3 HPLC条件进行分离后，采用Triple-TOF-MS/MS条件对食用植物油样品进行质谱分析，以相对分子质量为875的质谱离子的二级质谱图分析为例，如图1所示。首先，可以找到其准离子分子峰874.771 2m/z，在二级质谱中，可以找明显的碎片离子[DAG]+857.746 5m/z，与[DAG]+874.771 2m/z相比离子质量约减少了17m/z，表明失去了一个羟基；碎片离子[DAG]+601.510 0m/z，与[DAG]+857.746 5m/z相比离子质量约减少了256m/z，表明失去了一个棕榈酸(P)分子；碎片离子[DAG]+575.494 8m/z，与[DAG]+857.746 5m/z相比离子质量约减少了282m/z，表明失去了一个油酸(O)分子；碎片离子[DAG]+577.509 8m/z，与[DAG]+857.746 5m/z相比离子质量约减少了280m/z，表明失去了一个亚油酸(L)分子。

图1 相对分子质量为875的质谱离子的二级质谱图

根据脂肪酸在甘油骨架上分布的情况，酰化在Sn-1、Sn-3位的脂肪酸要比酰化在Sn-2位上的脂肪酸更容易断裂，因而从甘油骨架断裂一个Sn-1、Sn-3位脂肪酸形成的1,2-二酰基甘油离子或2,3-二酰基甘油离子的丰度高于从Sn-2位断裂一个脂肪酸形成1,3-二酰基甘油离子的丰度[8]。碎片离子[DAG]+577.509 8m/z的强度略低于[DAG]+575.494 8m/z和[DAG]+601.510 0m/z，因此推测该甘油三酯可能为PLO(忽略Sn-1、Sn-3位置异构)。同理，由此对菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油和玉米油甘油三酯进行鉴定，共得到35种甘油三酯，根据质谱母离子及碎片离子可进行定性，用面积归一化法得到其相对含量。芝麻油、菜籽油、大豆油等食用植物油的甘油三酯组成与含量见表4和表5。

从表4和表5可知，Triple-TOF-MS/MS可准确地确定相同ECN的不同甘油三酯的种类。6类植物油均含有LnLL、LLO、LOO、LLL、PLO、PLL和OOO 7种甘油三酯。在芝麻油中，共找到15种甘油三酯，其中只含有油酸和亚油酸的甘油三酯最多，占总甘油三酯含量的60%以上；在菜籽油中含量最多的甘油三酯分别是OOO、LOO和PLL。其中，高芥酸菜籽油中共有21种甘油三酯，是6种植物油中鉴定出最多的。此外在高芥酸菜籽油中还检测到很多含有芥酸的甘油三酯，如ELnP、AoLnE、ELE、EOE等。而在低芥酸菜籽油中，检测到17种甘油三酯；LLO、LOO和PLO是花生油中含量最高的3种甘油三酯，超过总含量的50%；大豆油中主要是LLL、LLO和PLL 3种甘油三酯，占总甘油三酯的46%以上；在葵花籽油和玉米油中都鉴定出15种甘油三酯，LLL、LLO和PLL含量最多的3种甘油三酯，同样表明葵花籽油和玉米油不仅在脂肪酸组成和含量上具有相似性，在甘油三酯上组成与含量上也高度统一。

表4 Triple-TOF-MS/MS测定的食用植物油甘油三酯组成及相对含量

注：“-”表示未检出；P.棕榈酸；S.硬脂酸；O.油酸；L.亚油酸；Ln.亚麻酸；A.花生酸；Ao.花生一烯酸；B.山嵛酸；E.芥酸；Li.木焦油酸。甘油三酯Sn-1、Sn-3位置异构未考虑。下同。

表5 Triple-TOF-MS/MS测定的食用植物油甘油三酯组成及相对含量

3 结 论

本文研究发现，常规的HPLC-ELSD法仅能对甘油三酯的碳原子当量数(ECN)轮廓进行初步鉴定，而Triple-TOF-MS/MS能够根据一级质谱母离子(加氢母离子、加钠离子和加氨母离子)相对分子质量以及二级质谱的碎片离子([DAG]+)对相同ECN的甘油三酯进行定性分析，采用该方法检测芝麻油、葵花籽油、大豆油、菜籽油、花生油和玉米油，共获得35种甘油三酯。其中6种植物油中均含有LnLL、LLL、LLO、PLL、LOO、PLO和OOO 7种甘油三酯。将Triple-TOF-MS/MS法应用于油脂中甘油三酯的检测，可为我国粮油品质控制及分析提供理论基础。