小单孢菌40027菌株内源质粒pJTU101的特性及其抗性标记

国家大学生创新创业训练项目(GCX12012)

小单孢菌40027菌株内源质粒pJTU101的特性及其抗性标记

李晓华，杨振飞，李阳，陶新园，吴金龙，刘涛，陈鑫，梅枫，马婷婷

(中南民族大学 生命科学学院，生物技术国家民委重点实验室，武汉 430074)

摘要从稀有放线菌小单孢菌40027菌株中分离到2个内源质粒pJTU101和pJTU112，用BamH I单酶切质粒pJTU101确定其大小，通过同源片段之间发生单交换实现内源质粒pJTU101的抗性标记，并对其稳定性进行了初步研究.结果表明：小单孢菌40027菌株内源质粒pJTU101拷贝数为1～2，大小约为36.6 kb，被阿泊拉霉素抗性基因标记且在小单孢菌40027 菌株中比较稳定.

关键词小单孢菌40027菌株；质粒pJTU101；抗性基因标记；稳定性

作者简介李晓华( 1968- )，男，教授，博士，研究方向：微生物学， E-mail：lixiaohua@mail.scuec.edu.cn

基金项目国家自然科学基金资助项目(31070087, 30570046)；湖北省自然科学基金重点项目(2011CDA079, 2008CDB076)；

中图分类号Q933文献标识码A

The Characteristic and Resistance Marker of Plasmid

pJTU101 fromMicoromonosporasp.40027

LiXiaohua,YangZhenfei,LiYang,TaoXinyuan,WuJinlong,LiuTao,ChenXin,MeiFeng,MaTingting

(Key Lab for Biotechnology of the State Ethnic Affairs Commission，

College of Life Science，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China)

AbstractTwo plasmids, pJTU101 and pJTU112, were isolated from Micoromonospora sp. 40027. The size of plasmid pJTU101 was identified by BamH I restriction patterns and plasmid pJTU101 was labeled via single crossover between homologous fragments. The stability of pJTU101 was also studied. The results suggested that the plasmid pJTU101 with copy number of 1～2, which was about 36.6 kb, had high genetic stability with apramycin-resistant gene marker in Micoromonospora sp. 40027.

KeywordsMicoromonospora sp. 40027；plasmid pJTU101；resistance marker；genetic stability

小单孢菌是一类具有复杂生活史的稀有放线菌，属于原核微生物，可产生多种重要的次级代谢产物[1,2].小单孢菌常见于水和土壤中，但主要生活在水生环境中[3,4].一些抗生素如庆大霉素、紫苏霉素、福堤霉素A等是小单孢菌所产生的较为常见产物[5]，而且有些小单孢菌还能产生有效杀死肿瘤细胞的生物活性物质，如从土壤和海洋中分离的小单孢菌可产生烯二炔类抗肿瘤抗生素，该药物是强效抗肿瘤抗生素[6]. 虽然已有研究利用的物理和化学手段诱变小单孢菌40027菌种，提高了福堤要素A的产量[7],但目前关于小单孢菌质粒的研究还很少，所分离获得的质粒也很少，谭华荣等[8]从庆大霉素产生菌——棘孢小单孢菌降红变种AS4890 中分离到一个6.8 kb 的质粒pME1，Hasegawa[9]从小单孢菌中分离了2个质粒，并用于了小单孢菌质粒载体的构建，Thomas[10]从小单孢菌中分离到质粒pMR2，并进行了全序列的分析.

本实验所用菌株为小单孢菌40027菌株[11]，可产生氨基糖苷类抗生素——福堤霉素A.本文以小单孢菌40027菌株内源质粒为研究对象，对质粒的大小、标记及标记后质粒的稳定性进行了初步研究.

1材料和方法

1.1材料和试剂

菌株和质粒：Micromonosporasp. 40027[11]、E.coliDH5α[12]、pOJ260[13]. 大肠杆菌(Escherichiacoli)使用 LB 培养基，于37℃培养.小单孢菌40027菌株固体培养基为贝奈特培养基[11]，液体培养基为菌丝体培养基[11]，于30℃培养.

Lambda/Hind III、氯霉素、限制性内切酶、卡那霉素、T4DNA连接酶(购自大连TaKaRa公司) ，阿泊拉霉素(购自美国Sigma公司) ，DNA Gel Extraction Kit(购自大连TaKaRa公司)，氯化钠、甘露醇、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉等(购自上海国药集团).

1.2质粒DNA的分离和纯化

参照文献[14]分离大肠杆菌质粒，参照文献[15]分离小单孢菌质粒.酶切后的DNA使用DNA Gel Extraction Kit 回收纯化.

1.3大肠杆菌DNA转化

参照文献[14] 制备大肠杆菌感受态细胞和对质粒DNA常规转化.

1.4小单孢菌电转化

参照文献[16]，取小单孢菌新鲜菌丝体或预萌发的孢子100 μL、质粒约50 ng，加入到预冷的2 mm电转化杯中，在Bio-Rad电穿孔仪上，设置电容25 μF，电阻200 Ω，在不同电场强度下电击，再将转化体系转入30℃温浴的900 μL菌丝体培养基中.30℃ 250 r/min，培养1 h.将菌液用菌丝体培养基按不同的比例稀释后取100μL涂布在贝奈特培养基上，24 h后用含阿泊拉霉素15 μg/mL的水溶液覆盖，30℃培养5～7d.

2结果与分析

2.1质粒的分离

提取小单孢菌40027 菌株的总DNA，检测到2个质粒(见图1)，分别命名为pJTU101 和pJTU112.对染色体DNA 与质粒pJTU101 DNA 带进行积分计算，初步确定质粒pJTU101 拷贝数为1～2.

M) λ DNA/Hind III Marker；A) 小单孢菌40027 菌株的总DNA 图1　小单孢菌40027菌株的总DNA的电泳分析 　　Fig.1　Electrophoresis analysis of total DNA of Micromonospora sp.40027

2.2质粒pJTU101的单酶切及其大小的确定

质粒pJTU101 经BamH I 酶解后，发现该质粒至少有5 条BamH I酶切片段(见图2)，测得该质粒的BamH I 酶解片段分别约为：16.0,8.0,5.5,5.5,1.6 kb，质粒pJTU101 约为36.6 kb.

M) λ DNA /Hind III Marker； A) 小单孢菌40027 菌株内源质粒pJTU101 BamH I 酶切带谱 图2　小单孢菌40027 菌株内源质粒pJTU101 BamH I 酶切的电泳分析 　Fig.2　Electrophoresis analysis of endogenous plasmid pJTU101 digested by BamH I of Micromonospora sp.40027

2.3内源质粒pJTU101抗性基因标记菌株的获得

质粒pJTU101 DNA用BamH I 部分酶切，与pOJ260 经BamH I 酶切，并用碱性磷酸化酶(CIAP)处理后的DNA，在T4 DNA 连接酶的作用下连接，再转化大肠杆菌DH5α，筛选阿泊拉霉素抗性大肠杆菌菌株.经快检后，提取其质粒DNA，经BamH I 酶切证明：获得了含有不同pJTU101BamH I 酶切片段插入到pOJ260 的质粒.选择其中一个含有8.0 kb pJTU101BamH I 酶切片段插入到pOJ260 的质粒(命名为：pJTU104)用于pJTU101 标记的质粒.

将pJTU104与小单孢菌40027菌株进行电转化，筛选得到阿泊拉霉素抗性小单孢菌40027菌株.提取阿泊拉霉素抗性小单孢40027菌株总DNA，以pJTU104 为探针，与阿泊拉霉素抗性小单孢菌40027菌株的总DNA 杂交.杂交结果(见图3)显示：阿泊拉霉素抗性小单孢菌40027菌株与pJTU104 有相一致的两条阳性信号，其中8.0 kb 的阳性信号与野生型小单孢菌40027 菌株总DNA 经BamH I 酶切后的样品(B)相一致；3.5 kb 的阳性信号与pOJ260 一致，表明质粒pJTU104 与小单孢菌40027 菌株内源质粒pJTU101 发生基因重组，小单孢菌40027 菌株内源质粒pJTU101被阿泊拉霉素抗性基因标记，该阿泊拉霉素抗性小单孢菌40027菌株命名为LXH1.

I为琼脂糖凝胶II上的DNA 转移到尼龙膜上 经Southern 杂交显影的照片； A) 阿泊拉霉素抗性小单孢菌40027菌株的 总DNA经BamH I 完全酶切片段； B) 野生型小单孢菌40027 菌株总DNA 经 BamH I 酶切后的样品；M) λ DNA/Hind III Marker； C) 质粒pJTU104 经限制性内切酶BamH I 完全酶切片段 图3　质粒标记菌株的Southern 杂交验证 Fig.3　Southern confirmation of the strain labeled of plasmid pJTU101

2.4抗性标记质粒的稳定性检测

为检测抗性标记质粒在小单孢菌LXH1菌株中的稳定性，将含有抗性标记质粒的小单孢菌LXH1菌株在未加抗生素的贝奈特培养基上进行4轮的非选择性培养生长后，挑取出200个单菌落分别转接至含有抗生素和不含抗生素的贝奈特培养基上.在2种平板都能生长的为质粒未丢失的菌落；在阿泊拉霉素的平板上不生长，而在不含抗生素的平板上生长的菌落有2种情况：(1) 标记质粒丢失，即为质粒消除菌株；(2) 标记质粒中2个同源的8.0 kb 片段间再次发生单交换，标记质粒恢复为原始的2个质粒，即内源质粒pJTU101和质粒pOJ260，质粒pOJ260 在小单孢菌40027 菌株中不能复制而丢失，而质粒pJTU101 未丢失，该菌株又恢复到野生型小单孢菌40027 菌株.

通过4轮非选择性培养，在前3轮非选择性培养后，未能筛选出阿泊拉霉素抗性消失的菌株；在前4轮非选择性培养后，挑取的200个菌落中筛选出4株阿泊拉霉素抗性消失的菌株，表示抗性标记质粒在小单孢菌40027菌株中较稳定.

3结语

福堤霉素A产生菌——小单孢菌40027菌株含有2个质粒pJTU101和pJTU112.本研究通过酶切初步确定了pJTU101的大小为36.6 kb，并通过同

源片段之间发生单交换实现内源质粒pJTU101的抗性标记，验证表明抗性标记质粒在小单孢菌中能稳定遗传.

近年来在小单孢菌中不断发现新的抗生素.小单孢菌日益受到了人们的重视和青睐，利用基因工程的手段可使小单孢菌实现高产量、改进质量及培育新抗生素产生菌，故发展和完善小单孢菌基因克隆系统十分必要.建立遗传操作系统是开发小单孢菌的重要步骤，而内源质粒的功能研究是发展遗传操作系统的一条捷径.

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