悬浮红细胞对CD4+CD25+Treg细胞分化的影响

赵学涛，杨从容，任晓亮，李　明，解晓元，巨红妹

(1.河北医科大学第四医院输血科，河北 石家庄 050011；

2.河北医科大学第四医院放疗科，河北 石家庄 050011)

·论著·

悬浮红细胞对CD4+CD25+Treg细胞分化的影响

赵学涛1，杨从容2，任晓亮1，李明1，解晓元1，巨红妹1

(1.河北医科大学第四医院输血科，河北 石家庄 050011；

2.河北医科大学第四医院放疗科，河北 石家庄 050011)

[摘要]目的体外观察悬浮红细胞对异体T淋巴细胞向CD4+CD25+Treg细胞分化的影响。方法采用Ficoll密度梯度离心法和免疫磁珠法从人外周血中分离纯化出CD3+T淋巴细胞，给予CD3/CD28抗体刺激，并分别与异体非去白悬浮红细胞或去白悬浮红细胞混合培养72 h。采用流式细胞仪检测各组培养体系中CD4+CD25+Treg细胞的比例。采用实时荧光定量PCR检测各组Foxp3 mRNA的表达情况。采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测各组细胞上清中促炎细胞因子[白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)和干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)]和抗炎细胞因子[白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)和转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)]的水平。结果与阴性对照组(细胞培养液组)比较，非去白悬浮红细胞和去白悬浮红细胞组CD4+CD25+Treg细胞比例明显增加，功能基因Foxp3 mRNA表达也明显增高；IL-2和IFN-γ促炎细胞因子分泌减少，IL-10和TGF-β抗炎细胞因子分泌增多(P<0.01)。而与去白悬浮红细胞比较，非去白悬浮红细胞作用更加明显(P<0.05)。结论悬浮红细胞可能通过调节促炎/抗炎细胞因子平衡诱导异体T淋巴细胞向CD4+CD25+Treg分化，而悬浮红细胞内残留的白细胞可能在其中起了关键作用。

[关键词]红细胞输注；T淋巴细胞；辅助诱导

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.06.016

临床研究证实，同种异体血输注(allogenic blood transfusion，ABT)可以诱导受血者产生免疫抑制，并由此增加术后感染率和恶性肿瘤的复发率[1-2]。目前这种输血相关免疫抑制的确切机制仍不清楚。CD4+CD25+T细胞是最近才被人们认识的一类免疫调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)，高表达CD25、CD4和Foxp3，通过多种途径参与机体的免疫无能和免疫抑制。异体成分血输注引起的免疫抑制是否与CD4+CD25+Treg有关目前国内外尚未见报道。为此本研究通过体外实验探讨悬浮红细胞对异体T淋巴细胞向CD4+CD25+Treg分化的影响及其可能机制。报告如下。

1资料与方法

1.1材料和试剂RPMI 1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司；人淋巴细胞分离液购自Axis Shield公司；CD3+T细胞磁珠分选试剂盒购自Miltenyi Biotec公司；抗CD3单克隆抗体、抗CD28单克隆抗体购自Becton Dickinson公司；异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的抗CD4单克隆抗体以及荧光素(phycoerythrin，PE)标记的抗CD25单克隆抗体均购自eBioscience公司；Western blotting试剂盒购于碧云天公司；ELISA检测试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。

1.2血液样品外周全血取自健康自愿献血者，去白悬浮红细胞和非去白悬浮红细胞由河北医科大学第四医院输血科提供。

1.3实验方法

1.3.1外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的分离取无菌肝素钠抗凝全血，用生理盐水将其等倍稀释，稀释后的血标本缓慢加入人淋巴细胞分离液液面上，比例为1∶1，4 ℃，2 000r/min离心15 min，轻轻吸取第二层环状乳白色单个核细胞层，以PBS液洗涤2次，所得白色细胞沉淀即为PBMC，计数细胞备用。

1.3.2磁珠分离纯化T淋巴细胞取1×107个PBMC，用PBS调整细胞溶液体积至50 μL；加入CD3抗体磁珠溶液10 μL，混匀，4 ℃孵育20 min；加入150 μL PBS洗涤细胞，4 ℃，3 000 r/min离心10 min；收集细胞重悬并调整细胞悬液体积至500 μL；将分选柱固定于磁柱上，用500 μL PBS预湿分选柱；将结合磁珠的细胞悬液加入分选柱内，洗涤3次，每次1 000 μL PBS；将分选柱从磁柱分开，加入1 000 μL PBS，收集流出液，4 ℃，3 000 r/min离心10 min，所得沉淀物即为富集的T淋巴细胞，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬，计数备用。

1.3.3混合培养 取上述T淋巴细胞悬液加入到含有CD3抗体(2 mg/L)和CD28抗体(5 mg/L)包被的96孔板中(1×105个细胞/100 μL /孔)，然后分3组，分别于上述T细胞悬液中加入细胞培养液100 μL /孔(阴性对照组)、非去白悬浮红细胞2×105个细胞/100 μL /孔(非去白悬浮红细胞组)和去白悬浮红细胞2×105个细胞/100 μL /孔(去白悬浮红细胞组)，每组终体积200 μL，设3个复孔。于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养72 h。

1.3.4CD4+CD25+T细胞比例检测混合培养72 h后，收集各组细胞，调整每管细胞数为2×105个，分别加入抗CD4+-FITC荧光抗体、抗CD25+-PE荧光抗体及相应同型对照，冰上孵育30 min，加入2%胎牛血清-PBS液洗涤去除未结合抗体，1 300 r/min离心6 min，洗2次，将细胞重悬至200 μL，应用EPics-XL Ⅱ型流式细胞仪检测。

1.3.5淋巴细胞Foxp3 mRNA表达检测混合培养72 h后，收集各组细胞，采用Trizol法提取细胞总mRNA，进行反转录和实时荧光定量PCR反应，引物由上海生工生物有限公司合成。使用QuantityOne软件进行定量分析，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参，计算Foxp3的相对表达量。

1.3.6细胞因子检测混合培养72 h后，收集各组细胞上清，采用ELISA法检测细胞因子白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)、干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)、转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)的表达水平。操作按照ELISA试剂盒说明书进行。

2结果

2.1悬浮红细胞对CD4+CD25+细胞比例和异体T淋巴细胞Foxp3 mRNA表达的影响与阴性对照组比较，非去白悬浮红细胞和去白悬浮红细胞组CD4+CD25+Treg 细胞比例和异体T淋巴细胞Foxp3 mRNA表达均明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)；非去白悬浮红细胞较去白悬浮红细胞组CD4+CD25+Treg细胞比例和异体T淋巴细胞Foxp3 mRNA表达更高(P<0.05)。见表1。

2.2悬浮红细胞对细胞因子的影响与阴性对照组相比，非去白悬浮红细胞和去白悬浮红细胞组上清中促炎细胞因子IL-2和IFN-γ含量明显减少(P<0.05)，而抗炎细胞因子IL-10和TGF-β含量明显增多(P<0.05)。非去白悬浮红细胞与去白悬浮红细胞组比较作用更加明显(P<0.05)。见表2。

表1　3组CD4+CD25+Treg细胞比例及Foxp3 mRNA表达比较　Table 1　CD4+CD25+Treg cells rate and Foxp3 mRNA expression in three groups　

*P<0.01与阴性对照组比较#P<0.05与非去白悬浮红细胞组比较(q检验)

表2　3组细胞因子含量比较　Table 2　Expression of IL-2,IFN-γ,IL-10 and TGF-β in three groups　

*P<0.01与阴性对照组比较#P<0.05与非去白悬浮红细胞组比较(q检验)

3讨论

同种异体输血发挥临床治疗作用的同时，也会并发免疫相关的不良反应，如恶性肿瘤复发率增加、术后感染率上升、慢性病毒感染急性发作等，这些输血引起的一系列涉及免疫调节的反应称为输血相关性免疫调节(transfusion-associated immunomodulation,TRIM)[3]。大量动物实验证实血液制剂中的白细胞与由白细胞和血小板分泌并随着储存时间延长而蓄积的可溶性生物反应介质是引起TRIM的主要机制[4-5]。众多临床资料也显示输注去白细胞的血液制剂可降低术后感染率和肿瘤复发率[6-7]。目前血液制剂中白细胞及其他生物活性分子是通过何种途径引起TRIM的机制仍不明确。

CD4+CD25+T细胞是是一类具有免疫调节功能的Treg，此细胞群高表达CD25+、CD4+和Foxp3，Foxp3是Treg分化和发挥功能的关键分子，被认为是Treg的特异性标记[8]。尽管Treg在T淋巴细胞中所占比例不大，但在调节体内免疫反应、维持机体内环境稳定和自身免疫耐受中起重要作用[9-10]。Treg具有免疫抑制性，可以非特异性的抑制CD4+和CD8+T细胞、自然杀伤细胞、B细胞以及其他免疫细胞的功能，进而降低机体对肿瘤和病原体的免疫应答。那么异体血输注引起的TRIM是否与Treg有关呢？本研究结果显示2组悬浮红细胞分别与CD3/CD28抗体刺激的T细胞混合培养后，均会增加培养体系中CD4+CD25+Treg细胞的比例，同时也会增加Foxp3 mRNA的表达水平；而与去白悬浮红细胞组相比，非去白悬浮红细胞的作用更加明显。提示悬浮红细胞可促进异体T淋巴细胞向CD4+CD25+Treg细胞分化，并且促进其功能增强，而这种作用可能主要依赖于悬浮红细胞内残留的白细胞。

此外，T细胞分泌的细胞因子在免疫调节中也起着重要作用。IL-2和IFN-γ主要由Th1细胞分泌，是促炎因子，可以促进免疫反应的发生；IL-10和TGF-β则主要由Th2和Treg细胞分泌，是抗炎因子，主要在免疫耐受和免疫抑制中起作用[11]。两类细胞因子互相平衡共同调节免疫反应，否则就会导致免疫功能的紊乱。研究证实Treg可抑制细胞因子IL-2的表达，从而阻断免疫排斥反应的发生[12]；而IL-10和TGF-β可诱导CD4+CD25+Treg的生成[13]。本研究结果显示，与阴性对照组相比，悬浮红细胞组培养体系中IL-10和TGF-β细胞因子含量增多，IL-2和IFN-γ含量减少，从而诱导T淋巴细胞高表达Foxp3并向CD4+CD25+Treg分化；而与去白悬浮红细胞组相比，非去白悬浮红细胞组的这种作用更加明显。提示悬浮红细胞可能通过调节促炎/抗炎细胞因子平衡诱导异体T淋巴细胞向CD4+CD25+Treg分化，从而参与异体血输注引起的TRIM，而悬浮红细胞内残留的白细胞在其中起了关键作用。但同时也提示除白细胞外，悬浮红细胞中还存在其他成分诱导CD4+CD25+Treg的分化，只是因其作用较小，在体内可能不足以引起广泛的免疫抑制，这种猜测还需要进一步的实验数据和临床证据来证实。

[参考文献]

[1]Bilgin YM,van de Watering LM,Versteegh MI,et al.Effects of allogeneic leukocytes in blood transfusions during cardiac surgery on inflammatory mediators and postoperative complications[J].Crit Care Med,2010,38(2):546-552.

[2]Linder BJ,Frank I,Cheville JC,et al.The impact of perioperative blood transfusion on cancer recurrence and survival following radical cystectomy[J].Eur Urol,2013,63(5):839-845.

[3]Vamvakas EC,Blajchman MA.Deleterious clinical effects of transfusion-associated immunomodulation:fact or fiction?[J].Blood,2001,97(5):1180-1195.

[4]Vamvakas EC.Possible mechanisms of allogeneic blood transfusion-associated postoperative infection[J].Transfus Med Rev,2002,16(2):144-160.

[5]Dzik WH.Apoptosis,TGF beta and transfusion-related immunosuppression:Biologic versus clinical effects[J].Transfus Apher Sci,2003,29(2):127-129.

[6]Garancini M,Degrate L,Carpinelli MR,et al.Impact of pre-storage and bedside filtered leukocyte-depleted blood transfusions on infective morbidity after colorectal resection:a single-center analysis of 437 patients[J].Surg Infect (Larchmt),2013,14(4):374-380.

[7]Koch M,Antolovic D,Reissfelder C,et al.Leucocyte-depleted blood transfusion is an independent predictor of surgical morbidity in patients undergoing elective colon cancer surgery-a single-center analysis of 531 patients[J].Ann Surg Oncol,2011,18(5):1404-1411.

[8]Liu Z,Fan H,Jiang S.CD4+T-cell subsets in transplantation[J].Immunol Rev,2013,252(1):183-191.

[9]Corthay A.How do regulatory T cells work? [J].Scand J Immunol,2009,70(4):326-336.

[10]Li Z,Li D,Tsun A,et al.FOXP3+regulatory T cells and their functional regulation[J].Cell Mol Immunol,2015[Epub ahead of print].

[11]Akdis CA,Akdis M.Mechanisms of immune tolerance to allergens:role of IL-10 and Tregs[J].J Clin Invest,2014,124(11):4678-4680.

[12]Fu W,Zhu J,Qiu Y,et al.Induction of CD4+CD25+T cells and control of cardiac allograft rejection by CD40/CD40L costimulatory pathway blockade in mice[J].Transplant Proc,2013,45(2):611-617.

[13]Iwasaki Y,Fujio K,Okamura T,et al.Toward therapeutic application of IL-10-producing regulatory T cells[J].Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi,2013,36(1):40-46. YM,van de Watering LM,Versteegh MI,et al.Effects of allogeneic leukocytes in blood transfusions during cardiac surgery on inflammatory mediators and postoperative complications[J].Crit Care Med,2010,38(2):546-552.

(本文编辑：赵丽洁)

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[收稿日期]2015-03-15；[修回日期]2015-04-22

[基金项目]河北省医学科学研究重点课题计划(20100442)

[作者简介]赵学涛(1977-)，男，河北阜城人，河北医科大学第

[中图分类号]R735.7

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2015)06-0682-04

Effect of red blood suspension on CD4+CD25+Treg differentiation
ZHAO Xue-tao1,YANG Cong-rong2,REN Xiao-liang1,

LI Ming1,XIE Xiao-yuan1,JU Hong-mei1

(1.Department of Blood Transfusion,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang

050011,China;2.Department of Radiation Oncology,the Fourth Hospital of Hebei Medical

University,Shijiazhuang 050011,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effect of red blood suspension on differentiation of CD4+CD25+Treg derived from allogene T lymphocytes in vitro and its underlying mechanism.MethodsCD3+T lymphocytes from human peripheral blood were isolated and purified by Ficoll density gradient centrifugation combined with adherence MACS selection.Purified human T cells were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 and then exposed to allogene leukocyte-containing red blood suspension or leukocyte-depleted red blood suspension for 72 h.The ratios of CD4+CD25+Tregs from different co-culture systems were detected by flow cytometry.The expression of Foxp3 mRNA was determined by real-time qPCR.The levels of pro-inflammatory cytokines such as interleukin-2(IL-2) and interferon-γ(IFN-γ) and anti-inflammatory cytokines like,interleukin-10(IL-10) and transforming growth factor beta(TGF-β) in the culture supernatant were determined by enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA).ResultsCompared with those of negative group (culture media),CD4+CD25+Tregs cells rate and Foxp3 mRNT expression in leukocyte-containing group and leukocyte-depleted group increased.At the same time,the cytokine of pro-inflammatory cytokines,IL-2 and IFN-γ,significantly decreased,and the anti-inflammatory cytokines,TGF-β and IL-10 increased significantly (P<0.01).The results of leukocyte-containing group were more prominent(P<0.05).ConclusionRed blood suspension could promote differentiation of T lymphocytes to CD4+CD25+Treg by regulating balance of pro-inflammatory/anti-inflammatory cytokines.The regulation,to a large extent,depends on the remaining white blood cells in red blood suspension.

[Key words]erythrocytes；T-lymphocytes；cytokines

四医院主管技师，医学博士，从事输血与肿瘤免疫研究。