白藜芦醇对梗阻性黄疸大鼠肠黏膜氧化应激损伤的影响

王　娜，唐雪婵，马伟平，郭　昱，赵东强，姜慧卿

(河北医科大学第二医院消化科，河北省消化病研究所，河北省消化病重点实验室，河北 石家庄 050000)

·论著·

白藜芦醇对梗阻性黄疸大鼠肠黏膜氧化应激损伤的影响

王娜，唐雪婵，马伟平，郭昱，赵东强，姜慧卿*

(河北医科大学第二医院消化科，河北省消化病研究所，河北省消化病重点实验室，河北 石家庄 050000)

[摘要]目的探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对试验性梗阻性黄疸(obstructive jaundice,OJ)大鼠肠黏膜氧化应激损伤的影响。方法健康雄性Wistar大鼠随机分为5组：假手术组、模型组、溶剂组、Res 10 mg组和Res 20 mg组各12只。模型组、溶剂组、Res 10 mg组和Res 20 mg组均结扎胆总管建立梗阻性黄疸大鼠模型，假手术组不结扎胆总管。采用鲎试剂终点显色法检测血浆内毒素含量，HE和透射电镜观察小肠黏膜组织形态学改变，应用比色法检测肠组织丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性，TUNEL法检测肠黏膜上皮细胞凋亡。结果实验处理2 周后,模型组血浆内毒素浓度较假手术组明显升高(P<0.05)。HE染色观察模型组大鼠腺体排列紊乱，绒毛变钝、短缩，伴有较多淋巴细胞、炎性细胞浸润。透射电镜示肠黏膜微绒毛明显稀疏，排列紊乱，细胞连接模糊、间隙增宽。肠黏膜组织MDA含量明显高于假手术组，SOD活性明显低于假手术组(P<0.05)。TUNEL法检测示模型组肠黏膜上皮细胞凋亡指数较假手术组明显升高。不同浓度Res干预后上述病理改变得到纠正，大鼠肠黏膜脂质过氧化产物MDA含量较模型组和溶剂组明显降低(P<0.05)，且SOD增加(P<0.05)；大鼠肠黏膜上皮细胞凋亡指数降低(P<0.05),Res 20 mg组较Res 10 mg组凋亡指数进一步降低 (P<0.05)。结论OJ大鼠存在肠黏膜氧化应激损伤，Res明显改善OJ大鼠高肠源性内毒素血症，提高肠黏膜的抗氧化作用，抑制肠上皮细胞凋亡，具有保护肠黏膜屏障作用。

[关键词]黄疸,阻塞性；肠黏膜；氧化应激；白藜芦醇；凋亡

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.06.001

梗阻性黄疸(obstructive jaundice,OJ)患者并发症发生率和病死率居高不下，其主要原因是肾衰竭和败血症[1]。基础与临床研究证实OJ存在肠黏膜屏障功能受损，主要病理生理机制是肠源性内毒素血症和肠黏膜通透性增加[2-3]，具体机制尚未明确，而肠黏膜氧化应激反应可能是导致OJ肠黏膜屏障功能障碍的关键因素[4]。白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种重要的植物抗毒素和抗氧化剂，可清除氧自由基，对于因氧化损伤引起的多种紊乱和失调疾患均有保护作用[5]。本研究建立OJ动物模型，探讨Res对OJ大鼠肠黏膜氧化应激损伤的影响及保护机制，旨在为OJ肠黏膜屏障功能障碍的治疗提供理论依据。

1材料与方法

1.1动物分组选取清洁级健康雄性Wistar大鼠(河北医科大学实验动物中心提供，合格证编号903194)，准确称质量，标记，随机分为5组：假手术组、模型组、溶剂组、Res 10 mg组和Res 20 mg组各12只。

1.2动物模型的制备和取材大鼠实验前12 h开始禁食，自由饮水。3%戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。取仰卧位，将动物四肢及头固定于操作台上，备皮、消毒、铺无菌洞巾，于上腹正中作3 cm切口进入腹腔，显露第一肝门，钝性游离并用3-0号丝线双重结扎胆总管，然后在两结扎线间横断，分2层缝合腹壁。假手术组仅进行腹腔游离，不结扎胆总管。整个操作均在无菌条件下进行，然后饲以正常饮水及复合饲料。自造模当天始用Res灌胃，1%羧甲基纤维素钠为溶剂。造模后2 周取材。门静脉取血测定内毒素，切取距回盲瓣约10 cm的小肠数段用生理盐水漂洗后中性甲醛固定用于小肠组织病理学检查和原位缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)染色，切取大小约1 mm×1 mm×1 mm组织以4%戊二醛固定，制备电镜标本，并留取少量肠组织-70 ℃低温冰箱保存用于丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性测定。

1.3主要试剂Res购自美国ALEXIS公司， TUNEL试剂盒购自美国金丰泰公司，终点显色法鲎试剂盒购自上海坤肯生物生物化工有限公司，MDA、SOD试剂盒购自南京建成生物技术有限公司，DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4血清内毒素检测器材无热原处理，标本置恒温融化后，取血清0.1 mL，加Tris-Hcl 0.2 mL，无热原0.9%氯化钠溶液0.2 mL混匀，置100 ℃水浴10 min，离心，取上清0.1 mL测定吸光度，从标准曲线中得出相应内毒素含量。

1.5肠黏膜形态学检测甲醛固定组织，石蜡包埋，连续切片，苏木精-伊红(HE)染色，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察肠黏膜形态变化。

1.6肠黏膜超微结构检测1%锇酸固定组织，丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片，铀染，铅染，透射电镜观察。

1.7肠黏膜组织MDA、SOD含量的检测准确称取肠组织块0.5 g，加4.5 mL生理盐水制成10%组织匀浆。取100 μL标本，按试剂盒说明采用硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量；黄嘌呤氧化酶法测定SOD含量。

1.8肠黏膜组织TUNEL染色参照TUNEL检测试剂盒说明书步骤进行。肠黏膜组织石蜡包埋切片经脱蜡、梯度乙醇脱水，蛋白酶K消化后，依次加入TUNEL反应混合液、Converter-POD。DAB显色，苏木精，复染，中性树脂封片。以不加TdT酶者作为阴性对照，细胞核呈棕色着色为阳性细胞。凋亡指数计算方法：计数每100个肠黏膜上皮细胞中凋亡细胞个数，每张切片任选3个视野，取其平均值。

2结果

2.1肠黏膜组织形态学观察光镜观察，假手术组大鼠肠黏膜上皮完整，绒毛腺体及排列整齐；模型组腺体排列紊乱，绒毛变钝、短缩，黏膜内杯状细胞减少，伴有较多的淋巴细胞、炎性细胞浸润，部分有淋巴滤泡形成。Res不同剂量治疗组肠黏膜病变较模型组明显减轻，肠黏膜腺体及绒毛排列整齐，炎性细胞浸润减少。见图1。

2.2肠黏膜组织超微结构观察透射电镜观察，假手术组大鼠肠黏膜微绒毛排列整齐，细胞连接紧密完整。模型组肠黏膜微绒毛明显稀疏，排列紊乱，连接复合体结构破坏，细胞连接模糊、间隙增宽； Res不同剂量治疗组肠黏膜上皮微绒毛排列整齐，细胞连接紧密。见图2。

2.3各组大鼠血浆内毒素、MDA 、SOD含量和凋亡指数比较模型组血浆内毒素浓度较假手术组明显升高(P<0.05)；Res 10 mg组和Res 20 mg组内毒素浓度明显低于模型组和溶剂组，Res 20mg组较Res 10 mg组降低更多，但仍高于假手术组(均P<0.05)。模型组肠黏膜组织中MDA含量明显高于假手术组 (P<0.05)，Res 10mg组和Res 20 mg组MDA含量明显低于模型组和溶剂组，Res 20 mg组较Res 10 mg组降低更多，但仍高于假手术组(均P<0.05)。模型组SOD明显低于假手术组(P<0.05)，Res 10 mg组和Res 20 mg组SOD明显高于模型组和溶剂组(P<0.05)，Res 20 mg组与Res 10 mg组间差异无统计学意义(P>0.05)，与假手术组之间差异也无统计学意义(P>0.05)。模型组凋亡指数较假手术组明显增加(P<0.05)，Res 10mg组和Res 20 mg组凋亡指数明显低于模型组和溶剂组(P<0.05)，Res 20mg组较Res 10 mg组降低更多(P<0.05)，与假手术组差异也无统计学意义(P>0.05)。见表1，图3。

表1　各组大鼠血浆内毒素、MDA 、SOD含量和凋亡指数比较Table 1　Plasma endotoxin，MDA,SOD concentrations and apoptotic index in different groups

*P<0.05与假手术组比较#P<0.05与模型组比较△P<0.05与溶剂组比较☆P<0.05与Res 10mg组比较(SNK-q检验)

3讨论

OJ是临床常见病，其存在不同程度的肠黏膜屏障损伤[6-7]，由于肠道细菌及内毒素移位继而导致内毒素血症及多器官功能损伤，这也是OJ并发症发生率和病死率居高不下的重要原因[8]，但是具体分子机制尚不清楚。OJ诱发肠黏膜氧化应激损伤是促成肠道屏障功能障碍和脓毒血症发生的一个关键因素。肠黏膜屏障受损伴随大量炎性因子释放，诱生型一氧化氮合酶表达增强，使肠黏膜组织及细胞内产生大量活性氧蓄积而导致氧化损伤，表现为肠黏膜蛋白氧化、脂质过氧化增强，蛋白质、非蛋白巯基化合物或二硫化物比例失调[9-10]。氧化应激可促进肠黏膜细胞凋亡，导致肠黏膜萎缩。肠黏膜细胞凋亡增加参与了病理状况下肠黏膜的病变过程，不利于肠黏膜上皮再生与修复，从而引起功能障碍[11-12]。

MDA是脂质过氧化反应的代谢产物，测试其含量可间接反映氧自由基对细胞的损伤程度；SOD能清除氧自由基，保护细胞免受损伤，是机体清除氧自由基的重要酶，超氧阴离子在SOD的作用下还原成过氧化氢，经过氧化氢酶的作用变成羟自由基，最终被还原成水。其活力的高低可间接反映机体清除氧自由基的能力，故MDA水平和SOD活力的测定可以反映机体的氧化和抗氧化平衡的状态[13-14]。本研究通过建立胆道梗阻的动物模型，进一步证明OJ大鼠存在高内毒素血症并伴有肠黏膜组织形态学损伤。光镜观察模型组大鼠腺体排列紊乱，绒毛变钝、短缩，伴有较多的淋巴细胞、炎性细胞浸润；透射电镜观察模型组大鼠肠黏膜微绒毛明显稀疏，排列紊乱，细胞连接模糊、间隙增宽；同时发现肠黏膜存在氧化应激损伤，MDA水平升高，SOD水平下降，肠黏膜上皮细胞凋亡指数明显增高。说明在OJ时肠道存在脂质过氧化损伤及抗氧化能力下降，肠黏膜上皮细胞凋亡增加，由此引起组织结构破坏削弱了肠道屏障功能，这也为细菌穿透及进一步肠源性内毒素血症发生提供可能。

Res属于黄酮类化合物，是从虎杖、葡萄皮等植物中提取的多酚化合物，是一种重要的植物抗毒素和抗氧化剂，具有清除氧自由基，可以抵御活性氧介质对DNA的损伤并且防止细胞膜发生脂质过氧化反应。近年来，越来越多的研究表明Res对许多器官、组织、细胞都具有保护作用[15-17]。本研究结果显示，Res治疗组较模型组及溶剂组大鼠小肠黏膜MDA水平降低，SOD水平增加，模型组肠黏膜上皮细胞凋亡较假手术组明显增加，Res治疗组大鼠肠黏膜上皮细胞凋亡指数较模型组和溶剂组明显降低，同时内毒素血症和肠黏膜组织形态和超微结构损伤得到改善。说明Res通过影响巯基氧化还原状态恢复肠黏膜的氧化应激状态,阻止肠黏膜细胞的凋亡，从而增强肠黏膜屏障功能，防止发生内毒素血症，其具体分子机制尚待进一步深入研究。

综上所述，肠黏膜氧化应激损伤和肠上皮细胞凋亡参与了OJ时肠黏膜屏障障碍的发生，在临床工作中OJ患者解除黄疸前后应同时保护肠黏膜屏障功能,因为肠黏膜屏障功能障碍以及伴随的内毒素血症和氧化应激损伤可能导致严重的甚至危及生命的并发症。Res明显改善OJ大鼠高肠源性内毒素血症，提高肠黏膜抗氧化作用，抑制肠上皮细胞凋亡，具有保护肠黏膜屏障作用，为日后开发Res治疗肠黏膜屏障功能障碍疾病提供了理论依据。(本文图见封二)

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(本文编辑：许卓文)

[收稿日期]2015-03-09；[修回日期]2015-04-01

[基金项目]河北省自然科学基金项目(H2014206177)

[作者简介]王娜(1975-)，女，河北辛集人，河北医科大学第二 *通讯作者。E-mail:jianghq@aliyun.com

[中图分类号]R575

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2015)06-0621-06

Resveratrol on oxidative stress injury of intestinal epithelial cell in obstructive jaundice rats

WANG Na,TANG Xue-chan,MA Wei-ping,GUO Yu,ZHAO Dong-qiang,JIANG Hui-qing*

(Department of Gastroenterology,the Second Hospital of Hebei Medical University,Hebei Key

Laboratory of Gastroenterology,Hebei Institute of Gastroenterology,Shijiazhuang 050000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of resveratrol(Res) on oxidative stress injury of intestinal epithelial cell in obstructive jaundice(OJ) rats.MethodsSham group was negative control group and solvent group as a positive control group, after two weeks′ experiment， the tissue samples were obtained.Healthy male Wistar rats were randomly divided into five groups:control group, model group,solvent group,Res 10 mg group and Res 20 mg group, each group contained 12 rats.OJ was successfully established in model group, solvent group,Res 10 mg group and Res 20 mg group after bile duct ligation.For control group,the choledochal duct was not ligated.Endpoint chromogenic assay with tachypleus amebocyte lysate was used to detect plasma endotoxin levels. HE stain method and transmission electron microscopy were used for morphological changes of intestinal mucosa.Colorimetric detection was made for intestinal tissue malondialdehyde(MDA) and superoxide dismutase(SOD) activity. The apoptosis of mucosal cells was detected by TUNEL methods.ResultsTwo weeks after the experimental treatment,the plasma endotoxin concentration of model group was higher than that of sham operation group(P<0.05).The histological examination showed the glands of rats in model group arranged disorderly,villous blunting,shortening,accompanied by many lymphocytes and inflammatory cell infiltration.Transmission electron microscopy showed mucosal microvilli was disarranged and distorted,cell gap widened,fuzzy connection.Compared with sham operation group,the intestinal lipid peroxidation of model group increased; the MDA content in intestinal mucosa of model group was significantly higher than that of sham operation group,but SOD of model group markedly reduced(P<0.05).TUNEL analysis showed the intestinal epithelial cell apoptosis index of model group was significantly higher than that of sham operation group.The above pathological changes were corrected after being treated with Res in different concentrations,the content of MDA in intestinal mucosa significantly decreased compared with model group and solvent group(P<0.05),but SOD increased(P<0.05); The apoptotic index of mucosal cells in Res 20 mg treated group was significantly lower than that in Res 10 mg treated group(P<0.05).ConclusionThe intestinal epithelial cell in OJ rats results in high oxidative stress injury,Res can protect the intestinal mucosal barrier function in OJ rats through significantly ameliorating intestinal endotoxemia,improving the antioxidant function of intestinal mucosa,inhibiting the apoptosis of intestinal epithelial cells.

[Key words]jaundice,obstructive;intestinal mucosa;oxidative stress;resveratrol;apoptosis

医院副主任医师，医学博士，从事消化内科疾病诊治研究。