脂肪酸结合蛋白评价大鼠缺血性心肌损伤的价值

脂肪酸结合蛋白评价大鼠缺血性心肌损伤的价值

余雷李醇文黄明钜1宁宗2

(重庆医科大学附属第二医院急救部，重庆400000)

摘要〔〕目的探讨脂肪酸结合蛋白(H-FABP)在异丙肾上腺素诱导的心肌缺血中对评价心肌损伤中的价值。方法将128只大鼠随机分成4组，采用异丙肾上腺素建立不同程度的心肌缺血模型，分为正常对照组和低、中、高剂量实验组，取4个时间点，用Western印迹法检测不同程度心肌缺血大鼠血清中H-FABP表达水平，分析心肌缺血后血清H-FABP含量与时间关系，分析大鼠心肌缺血严重程度与血清H-FABP含量之间关系。结果①心肌缺血大鼠模型建立成功，大鼠心肌缺血后血清中H-FABP含量2 h已有升高，4 h明显增高，与正常对照组差异显著(P<0.05)，16 h已有下降，32 h基本降至正常。②大鼠血清H-FABP升高的倍数随其心肌缺血程度加重而递增(P<0.05)。结论H-FABP在心肌缺血发生的早期即有明显升高，持续时间较短，H-FABP可作为缺血心肌损伤早期诊断的心肌标志物和评价损伤程度指标。

关键词〔〕心肌缺血；脂肪酸结合蛋白；蛋白免疫印迹

中图分类号〔〕R466〔文献标识码〕A〔

基金项目：广西教育厅科研资助项目(No.201012MS063)

通讯作者：宁宗(1968-)，男，博士，主任医师，硕士生导师， 主要从事急诊危重症、急性中毒救治研究。

1重庆市三峡中心医院2广西医科大学第一附属医院急诊科

第一作者：余雷(1982-)，男，硕士，住院医师，主要从事急诊危重症研究。

心肌缺血性损伤，特别是急性心肌梗死(AMI)是严重威胁人类生命健康的主要疾病之一，对AMI的早期诊断及缺血导致心肌损伤程度的评价尤为重要，目前诊断AMI的重要指标有肌酸激酶(CK),肌酸激酶同工酶(CK-MB)等，对其测定存在早期诊断灵敏度不高，损伤程度评价特异性差等不足。心肌脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是一种高度特异性的主要分布在心肌细胞内的低分子量可溶性蛋白，在心肌细胞受损时能快速从心肌细胞释放进入血液〔1,2〕，在心肌梗死后患者血液中出现早，且特异性较高〔3〕。本研究采用盐酸异丙肾上腺素构建大鼠心肌缺血模型，通过检测心肌缺血后的大鼠血清中H-FABP的表达，探讨H-FABP含量变化与心肌缺血后时间关系，评价与心肌缺血程度的关系。

1材料与方法

1.1 动物及分组健康Wistar大鼠128只，雌雄不限，体重140～150 g，由广西医科大学动物实验中心提供，随机分为正常对照组(腹腔注射生理盐水20 mg/kg)，低、中、高剂量实验组(腹腔注射盐酸异丙肾上腺素10、20、40 mg/kg)，每组32只，随机分配。

1.2 主要试剂与仪器盐酸异丙肾上腺素购于上海禾丰有限公司，血液总蛋白提取试剂盒购于北京白泰克生物技术有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo公司，H-FABP和GAPDH羊抗鼠一抗购自Santa Cruz Biotechnology,Inc，PVDF膜购自北京索莱宝科技有限公司，红外荧光染料标记的驴抗羊二抗购自美国LI-COR公司，成像系统为统美国LI-COR公司的Odyssey双色红外荧光成像系统，图像分析软件为LI-COR公司开发的Odyssey。

1.3 方法

1.3.1 心肌缺血大鼠模型的建立按照10、20、40 mg/kg计算，准备药物，每组每只大鼠所需注射盐酸异丙肾上腺素的量，分别为1、2、4 ml，正常对照组即注射生理盐水2 ml。注射后2 h做心电图观察。在用药后第2、4、16、32小时4个时间点在每组中分别随机取出8只大鼠，挖眼球取血4 ml左右，置于无菌离心管中，用血液总蛋白提取试剂盒提取总蛋白。

1.3.2 Western印迹法检测H-FABP表达将提取的大鼠血清总蛋白用BAC法测定蛋白浓度，体积按4∶1加5×上样缓冲液混匀，根据测算的浓度确定30 μg为上样量，换算出各自的实际上样体积，用普通PCR仪煮沸5 min变性，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白(5%浓缩胶，12%中间胶，15%分离胶)，浓缩胶跑40 V的恒压，分离胶跑80 V的恒压，按照蛋白质Marker切下H-FABP和GAPDH胶段，转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭非特异抗原2 h，PBS-T洗涤1次，5 min，分别加入1∶800稀释的H-FABP羊抗鼠多克隆抗体和1∶1 000稀释的羊抗鼠GAPDH多克隆抗体，室温1 h，4℃过夜。PBS-T洗涤4次，每次5 min。在分别加入1∶10 000稀释的红外荧光染料标记的驴抗羊二抗，室温震摇2 h，PBS-T洗涤3次，每次5 min，PBS洗涤1次,10 min。美国LI-COR公司的Odyssey双色红外荧光成像系统扫描，采用Odyssey分析软件进行条带灰度值的分析。每个样本条带与相对应样本GAPDH条带的灰度值相比，求出其比值即为H-FABP的相对表达量。

1.4 统计学方法采用SPSS17.0软件进行方差分析。

2结果

2.1 大鼠心肌缺血模型构建成功与正常对照组大鼠比较，各实验组注射盐酸异丙肾上腺素后其心电图出现典型的心肌缺血性改变(ST段抬高，T波倒置，病理性Q波)，剂量越大心肌缺血越严重，表明大鼠心肌缺血模型构建成功。见图1。

2.2 Western印迹法检测不同时间点大鼠血清H-FABP表达如图2、表1所示，实验组大鼠血清H-FABP含量在注射盐酸异丙肾上腺素后2 h已有升高，4 h更高，药物剂量增大血清H-FABP含量增高(P<0.05)，在心肌缺血后16 h已有下降，32 h

图1　各组大鼠心电图变化

1～4：正常对照组、低、中、高剂量实验组 图2　 Western印迹检测各组不同时间点 大鼠血清H-FABP表达

组别2ph16p2h正常对照组0.69±0.320.71±0.240.74±0.260.59±0.23低剂量实验组2.03±0.941)3.29±1.151)2)3)2.54±1.261)0.63±0.253)中剂量实验组3.36±1.221)4.37±1.361)2)3)2.73±1.151)1.12±0.463)高剂量实验组4.30±1.841)2)6.58±2.461)2)3)4.21±1.961)2)1.34±0.441)3)

与同时间点正常对照组比较：1)P<0.05，与同时间点其他实验组比较：2)P<0.05，与同剂量组不同时间点比较：3)P<0.05

基本降至正常(P<0.05)，心肌缺血程度越严重，H-FABP含量越高(P<0.05)。

3讨论

H-FABP是一种小分子量(约15 000)的胞质蛋白，富含于心肌细胞内，具有心肌特异性，与心肌细胞内的长链脂肪酸相结合，将其从细胞质膜向脂化和氧化部位运输，从而进入能量代谢体系氧化分解，最终生成三磷酸腺苷，为心肌收缩提供能量〔4〕，由于心肌细胞对缺血缺氧高度敏感〔5,6〕，当心肌缺血时，需要动员脂肪酸供能，导致心肌细胞内H-FABP迅速升高，又由于其分子量小，可快速释放入血，其血浆浓度在心肌细胞因缺血受损后 1.5～3 h开始升高，6～8 h达峰〔1,2〕。本研究结果与上述结果一致，提示血清H-FABP浓度可用于心肌缺血早期诊断。McCann等〔7〕在664 例因胸痛入院患者的研究发现，患者在胸痛症状出现4 h内检测，其H-FABP诊断急性心肌梗死的敏感性要远远高于肌钙蛋白T(cTnT)(73%比55%，P=0.043)，其特异性为71%，而其他心肌标志物诊断急性心肌梗死的敏感性和特异性都未超过cTnT。Glatz等〔8〕通过研究也曾推荐H-FABP可作为急性心肌梗死早期诊断的心肌标志物。本次研究还发现，在大鼠心肌缺血后16 h已有下降，在32 h基本降至正常，此发现与Chan等〔9〕研究结果一致，他们通过代谢动力学研究显示H-FABP血浆浓度于梗死后早期快速升高并达到顶峰，但血浆浓度恢复正常的时间也相对早，只需要30 h，具有较高的敏感性。

本研究发现，随着盐酸异丙肾上腺素剂量的增大，大鼠心肌细胞缺血越严重，通过Western印迹法检测大鼠血清中H-FABP的含量亦是越高的，心肌缺血严重性增加，心肌梗死的面积相应扩大，表明H-FABP高低与心肌梗死面积大小是正相关的。临床上AMI 后心肌梗死面积的评估对于预后判断有着重要价值，梗死面积常通过一些间接方法估算，如心脏超声(射血分数，室壁运动异常)、心肌核素灌注显像、心电图的改变(累及的导联数)、 CK-MB峰值等。H-FABP在胸痛发作后迅速释放入血并在较短时间内清除，若按足够的频度采集标本，可用于早期测定AMI 的梗死面积。Glatz等〔10〕和 Sohmiya等〔11〕的研究证实，应用血浆H-FABP测定梗死面积与CK-MB、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)测定梗死面积的相关性非常好，H- FABP的优点在于比CK-MB、α-HBDH能更早地测定梗死面积，它们各自需要的时间是24、48、72 h。 另外，心力衰竭时由于心肌细胞相对缺血、缺氧，其结构和功能都会发生改变，造成心肌损伤，而且心力衰竭越严重，这种损伤越明显，加重心肌缺血，Komamura等〔12〕曾对92 例扩张型心肌病患者进行4年随访，观察患者血浆H-FABP的浓度变化，结果发现血浆H-FABP浓度≥5．4 ng/ml的患者与低于此浓度的患者相比，生存率明显降低(P<0．000 1)。

总之，H-FABP作为灵敏的心肌缺血生化指标，在AMI早期诊断，评估梗死面积等方面均有重要临床价值，但由于存在时间窗，H-FABP检测若能与CK、CK-MB、cTnI等标志物结合应用，临床意义更大。

4参考文献

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12Komamura K，Sasaki T，Hanatani A，etal．Heart-type fatty acid binding pro-tein is a novel prognostic marker in patients with non-ischemic dilated cardio-myopathy〔J〕.Heart，2006;92(5):615-8.

〔2014-03-21修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)