硫化氢对糖尿病大鼠心脏MMP-2与MMP-12的影响

硫化氢对糖尿病大鼠心脏MMP-2与MMP-12的影响

罗健吴志雄周松柏肖婷李芳杨军

(南华大学附属第一医院心血管内科，湖南衡阳421001)

摘要〔〕目的探讨气体信号分子硫化氢(H2S)对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠基质金属蛋白酶(MMP)-2及MMP-12的影响。方法SD大鼠随机分为对照组、糖尿病大鼠组(STZ组)、H2S干预糖尿病大鼠组(STZ+H2S组)及H2S干预正常大鼠组(H2S组)。腹腔注射STZ 40 mg/kg建立糖尿病模型；糖尿病模型建立后，STZ组与H2S组每天腹腔注射浓度为100 μmol/kg的硫氢化钠溶液(H2S供体)；8 w后处死大鼠，Western印迹检测各组大鼠心脏MMP-2和MMP-12蛋白的表达。结果糖尿病大鼠心脏MMP-2与MMP-12表达水平明显减低(P<0.01,P<0.05)，H2S可以明显上调糖尿病大鼠心脏MMP-2与MMP-12的表达(P<0.01)；结论H2S可通过上调MMP-2及 MMP-12的表达，改善心肌纤维化。

关键词〔〕硫化氢；糖尿病；心肌纤维化；MMP-2；MMP-12

中图分类号〔〕R542.2〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金(No.81202830)；湖南省自然科学基金(11JJ2046)

通讯作者：杨军(1972-)，男，主任医师，博士，硕士生导师，主要从事心血管疾病研究。

第一作者：罗健(1988-)，男，硕士，主要从事心血管疾病研究。

心脏是糖尿病患者中最易受损伤的器官之一，表现为心肌重构，最终导致心脏收缩和(或)舒张功能障碍〔1〕，心肌纤维化与心脏收缩、舒张功能联系尤为密切。硫化氢(H2S)是一种新型气体信号分子，在心血管系统中，H2S作为一种心脏保护剂，有抗动脉粥样硬化、调节血压等生理作用〔2〕。H2S能够改善糖尿病心脏重构，对肺纤维化和肝纤维化都有改善作用〔3,4〕，提示H2S是一种有效的抗纤维化剂。本研究观察基质金属蛋白酶(MMP)-2及MMP-12在糖尿病大鼠心脏表达的变化及H2S对MMP-2和MMP-12表达的影响。

1材料与方法

1.1实验动物成年的雄性SD大鼠，体重(300±20)g，购自长沙动物实验中心。动物饲养在恒温(23±1)℃、恒湿(60%)的环境中，白天黑夜各12 h；实验动物可以自由获得食物和水。

1.2主要实验试剂硫氢化钠(H2S供体)购于美国Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒、细胞裂解液购于上海碧云天公司；兔源性MMP-2及MMP-12一抗购于中国博士德公司；抗兔二抗购于美国Proteintech公司。

1.3实验分组及糖尿病模型建立饲养SD大鼠1 w，使其适应环境。将SD大鼠随机分为对照组、糖尿病大鼠组(STZ组)、H2S干预糖尿病大鼠组(STZ+H2S组)及H2S干预正常大鼠组(H2S组)。STZ组与STZ+H2S组大鼠根据体重腹腔注射STZ(40 mg/kg)，注射后的24 h，为防止大鼠发生低血糖休克，给予5%葡萄糖水；注射后72 h，尾静脉采血测血糖，血糖>16.7 mmol/L提示造模成功。造模成功后，对照组每天腹腔注射生理盐水；STZ组与H2S组每天腹腔注射硫氢化钠溶液(100 μmol/kg)，实验持续8 w。

1.4Western印迹检测MMP-2及MMP-12的表达取新鲜大鼠心脏组织，研磨、离心后提取蛋白；采用BCA比色法进行蛋白定量。各组用PBS稀释至相同浓度，蛋白样品在100℃煮沸5 min；配制10%SDS-PAGE 分离胶、5%浓缩胶；按每孔20 μl蛋白样品上样，置于电泳缓冲液中电泳，分离目的蛋白，将目的条带切下，半干转法转膜(10 V， 30 min)，将蛋白质转移至PVDF膜。用TBST配制的5%BSA封闭2 h，封闭后分别孵育MMP-2及MMP-12一抗(稀释度均为1∶500)，4℃过夜；用TBST洗膜；每次10 min；用HRP标记的二抗(稀释度为1∶2 000)37℃孵育1 h，TBST洗膜，ECL显色，曝光后扫描，用Image J图像分析软件进行光密度分析。

1.5统计学分析采用SPSS18.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1H2S对糖尿病大鼠心脏MMP-2表达的影响糖尿病大鼠心脏MMP-2表达明显下降(P<0.01)，而使用H2S处理的糖尿病大鼠心脏MMP-2表达显著上升(P<0.01)；H2S处理的正常大鼠的心脏MMP-2表达无明显变化，见图1。

2.2H2S对糖尿病大鼠心脏MMP-12表达的影响糖尿病大鼠心脏MMP-12表达明显下降(P<0.05)，H2S也能上调糖尿病大鼠心脏MMP-12表达(P<0.01)，见图2。

图1　H 2S对MMP-2表达的影响

图2　H 2S对MMP-12表达的影响

3讨论

心血管病并发症是糖尿病最主要的死亡原因，终末期的临床表现就是心脏收缩和(或)舒张功能障碍，也就是心力衰竭。从病理学的角度分析主要是由于糖尿病患者心脏发生重构，包括了心肌细胞肥大和心肌纤维化〔5〕；其中心肌纤维化表现为心肌细胞外基质增多，心肌胶原纤维增加，胶原排列紊乱，这一系列的病理改变会导致心脏顺应性下降，对心脏收缩和舒张功能产生负面影响〔6〕。MMP-2与MMP-12可能作为一种抗纤维化的蛋白，维持心脏细胞外基质的动态平衡，而高血糖导致MMP-2及MMP-12表达下调，导致心肌纤维化，H2S可能通过上调这两种MMP改善糖尿病大鼠心肌纤维化。

MMPs是调节细胞外基质平衡的一种重要的酶系统，MMP-2属于明胶酶类，有研究〔7,8〕表明其在糖尿病心脏中表达明显降低，这与本研究结果相同。MMP-12对心肌纤维化的影响尚无报道，但其可以激活其他MMPs，如MMP-3、MMP-3，使胶原蛋白降解的作用加快、放大〔9〕。H2S是一种具有广泛生理功能的气体信号分子。H2S的抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，在心血管系统和神经系统中扮演着保护剂的角色。H2S能够改善糖尿病心脏重构，对肺纤维化和肝纤维化都有改善作用，提示H2S是一种有效的抗纤维化剂。本研究发现H2S明显逆转了糖尿病所致大鼠心脏MMP-2及MMP-12表达下降，提示H2S可能通过上调MMP-2及MMP-12表达改善糖尿病心肌纤维化。本实验是对H2S对糖尿病纤维化改善作用的初步探讨，其保护作用的信号转导、途径等具体机制有待深入研究，为糖尿病心肌病的预防及治疗提供一个新的研究思路。

4参考文献

1Schannwell CM,Schneppenheim M,Perings S,etal.Left ventricular diastolic dysfunction as an early manifestation of diabetic cardiomyopathy〔J〕.Cardiology,2002;98(1-2):33-9.

2Mani S,Li H,Untereiner A,etal.Decreased endogenous production of hydrogen sulfide accelerates atherosclerosis〔J〕.Circulation,2013;127(25):2523-34.

3沈钦海,秦召敏,逯爱梅.硫化氢对大鼠肝纤维化的预防作用〔J〕.中南大学学报(医学版),2012;37(9):911-5.

4李虹,刘新民,耿彬,等.新型气体信号分子硫化氢在大鼠肺纤维化发病中的作用〔J〕.北京大学学报(医学版),2006;40(2):140-5.

5Guan SJ,Ma ZH,Wu YL,etal.Long-term administration of fasudil improves cardiomyopathy in streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕.Food Chem Toxicol,2012;50(6):1874-82.

6Galderisi M.Diastolic dysfunction and diabetic cardiomyopathy:evaluation by Doppler echocardiography〔J〕.J Am Coll Cardiol,2006;48(8):1548-51.

7Mohamad HE,Askar ME,Hafez MM.Management of cardiac fibrosis in diabetic rats;the role of peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPAR-gamma) and calcium channel blockers (CCBs)〔J〕.Diabetol Metab Syndr,2011;3(1):4.

8王国贤,王蕾蕾.葛根素对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响〔J〕.江苏大学学报(医学版),2011;21(4):294-7,72.

9Edelstein C,Shapiro SD,Klezovitch O,etal.Macrophage metalloelastase,MMP-12,cleaves human apolipoprotein(a) in the linker region between kringles IV-4 and IV-5.Potential relevance to lipoprotein(a) biology〔J〕.J Biol Chem,1999;274(15):10019-23.

〔2014-10-17修回〕

(编辑李相军)