二甲双胍抑制晚期糖基化终产物诱导的大肠癌细胞侵袭和上皮间质转化

二甲双胍抑制晚期糖基化终产物诱导的大肠癌细胞侵袭和上皮间质转化

郭娜1逄曙光

(章丘市人民医院输血科，山东章丘250200)

摘要〔〕目的探讨二甲双胍对人大肠癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化(EMT)的影响。方法采用噻唑蓝(MTT)法评估暴露于晚期糖基化终末产物(AGEs)(100 μg/ml)和二甲双胍(10 mmol/L)后，SW480细胞存活率；采用碘化丙啶(PI)染色和流式细胞仪检测细胞周期；采用Annexin V和PI双染色检测细胞凋亡；应用Transwell迁移实验评估细胞的侵袭能力；应用免疫印迹法检测EMT相关标志蛋白E-cadherin和Vimentin的表达。结果在AGEs预处理的SW480细胞，二甲双胍抑制其增殖，诱导细胞周期阻滞在G0/G1期，增强细胞凋亡；二甲双胍也降低肿瘤细胞的侵袭和EMT，增加E-cadherin蛋白表达、降低Vimentin蛋白表达。结论二甲双胍对AGEs诱导的大肠癌细胞显示了抗肿瘤效应，其机制可能与抑制EMT过程有关。

关键词〔〕大肠癌；二甲双胍；晚期糖基化终末产物；糖尿病；上皮间质转化

中图分类号〔〕R735.3+4〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金资助(81170771，81270175)；山东省科技发展计划(2012GSF11803)；济南市国际合作计划项目(201011008)

通讯作者：逄曙光(1966-)，女，主任医师，教授，博士生导师，主要从事内分泌病研究。

1山东大学附属济南市中心医院

第一作者：郭娜(1982-)，女，主治医师，主要从事内分泌病研究。

Decreased invasion and epithelial mesenchymal transition in AGEs induced colorectal cancer cells by Metformin

GUO Na, PANG Shu-Guang.

Zhangqiu Municipal People's Hospital, Zhangqiu 250200, Shandong, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of Metformin on the proliferation, invasion and epithelial-mesenchymal transition (EMT) of human colorectal cancer (CRC) cells.MethodsMTT assay was used to assess viability of SW480 cells after exposure to advanced glycation end-products (AGEs) (100 μg/ml) and metformin (10 mmol/L). Cell cycle analysis was performed by Propidium iodide (PI) staining and flow cytometry. Apoptosis was detected by Annexin V-FITC and PI double staining. Transwell migration assays was performed to assess cell invasion. The expressions of E-cadherin and Vimentin were detected by Western blot.ResultsMetformin decreased proliferation, induced cell cycle arrest in G0/G1 phase and enhanced apoptosis. Metformin also decreased cell invasion and EMT induced by AGEs treatment, which was evidenced by increasing E-cadherin protein expression and decreasing Vimentin protein expression.ConclusionsMetformin has effects on proliferation, cell cycle, apoptosis, invasion, and EMT of human CRC cells induced by AGEs.

【Key words】Colorectal cancer (CRC); Metformin; Advanced glycation end-products (AGEs); Diabetes mellitus; Epithelial-mesenchymal transition (EMT)

大肠癌(CRC)患者的死亡主要是由于肿瘤的侵袭和转移造成的，特别是在晚期肿瘤。晚期糖基化终末产物(AGEs)是指蛋白质、脂质或核酸等大分子自发与葡萄糖或其他还原单糖在没有酶参与的条件下反应生成的稳定的共价加成物，与糖尿病的慢性并发症密切相关〔1〕。二甲双胍是一种胰岛素增敏剂，用于降低胰岛素抵抗性和恢复胰岛素敏感性〔2〕。在前列腺癌、胰腺癌等肿瘤中，二甲双胍具有显著的抗肿瘤效应〔3〕。应用二甲双胍治疗糖尿病患者，其CRC的发病率显著降低〔4〕。但在CRC中，二甲双胍的抗肿瘤作用是否通过AGEs诱导的病理机制发挥作用还不清楚。本研究拟探讨二甲双胍对AGEs诱导处理的CRC细胞的作用及其机制，以期为CRC的治疗提供新的思路和方法。

1材料与方法

1.1材料与试剂人CRC细胞株SW480购自中科院上海生命科学院细胞库。二甲双胍购自美国Calbiochem公司。AGEs，二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司。胎牛血清由杭州四季青生物工程公司生产。DMEM(高糖)为美国Gibco产品。小鼠抗人E-cadherin，Vimentin和β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠第二抗体，均购自美国Santa Cruz公司。Matrigel胶购自BD Biosciences 公司。

1.2细胞培养将SW480细胞以(2～4)×105/ml密度接种于含10%胎牛血清(FBS)的高糖型DMEM培养液中常规培养，培养液中同时补充有100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和2 mmol/L谷氨酰胺。培养置于37℃、饱和湿度、含5%CO2的培养箱内培养。每2～3 d传代1次。用0.25%胰酶消化生长至对数生长期后的细胞，含10%胎牛血清的DMEM配成细胞悬液，以2×104/ml浓度接种于96孔或24孔培养板，每组设3个复孔，每孔加入100 μl DMEM培养液。培养过夜后如细胞贴壁良好，换用无血清的DMEM培养24 h，使其生长同步化，然后加入AGEs(100 μg/ml)处理。正常对照组为SW480细胞加入等量的磷酸盐缓冲液(PBS)。

1.3细胞增殖试验用噻唑蓝(MTT)法测定二甲双胍对SW480细胞的细胞毒作用，通过检测活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶间接反映活细胞数。将对数生长期的SW480细胞以2×105细胞/ml密度接种于96孔细胞培养板，每孔100 μl，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液，加入AGEs(100 μg/ml)预处理，然后加入二甲双胍(10 mmol/L)，培养12、24、48、72 h后取细胞测细胞活力。每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，置于37℃、暗处孵育4 h后，离心3 000 r/min、10 min，使蓝紫色产物formazan沉淀下来。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入100 μl 二甲基亚砜(DMSO)，置于37℃充分溶解后，在酶标仪上570 nm处测定OD值。

1.4细胞周期应用碘化丙啶(PI)染色分析DNA含量来测定细胞周期。对数生长期的SW480细胞用无血清的DMEM培养24 h，使其生长同步化。然后以2×104/ml浓度接种于24孔培养板，分为对照组、AGEs组、二甲双胍组和AGEs+二甲双胍组。培养24 h后，每组收集(1～2)×106细胞，离心3 000 r/min，5 min。PBS液洗涤后，边震荡沉淀细胞，边加入75%乙醇，放置于4℃固定24 h。PBS再洗涤1次，离心后，加PI溶液(PI终浓度50 μg/ml；RNaseA终浓度0.5 mg/ml)，放置于室温，暗处15 min，流式细胞仪检测。

1.5细胞凋亡用Annexin V-FITC和PI双染检测细胞凋亡。对数生长期的SW480细胞培养24 h后，每组收集2×105细胞，离心3 000 r/min，5 min。PBS洗涤后用100 μl 1×binding buffer重悬细胞，加2.5 μl Annexin V和5 μl PI(终浓度10 μg/ml)，暗处放置15 min，流式细胞仪检测。

1.6细胞侵袭试验采用Boyden小室侵袭实验检测SW480细胞的侵袭能力。Transwell小室的下室加入500 μl培养液，加100 μl SW480细胞悬液于Transwell小室的上室。培养24 h后，取出Transwell小室，用乙醇常规固定滤膜，锥虫蓝染色。穿过滤膜的细胞多数黏附在滤膜下表面，因此用棉签拭去滤膜上室面的细胞，镜下计数穿过Matrigel胶细胞数。每组设3复孔。4个实验组分别设定无Matrigel胶的孔作为空白组，以空白组的穿膜细胞数为分母，各实验组穿过Matrigel胶的细胞数为分子，得到的百分率作为癌细胞体外侵袭指数。

1.7免疫印迹分析收获细胞后，用PBS洗涤，0.25%胰蛋白酶消化，收集所有细胞后离心，用Bradford 法测定蛋白质含量。每孔取50 μg总蛋白与蛋白上样缓冲液混合后煮沸5 min。蛋白上样后，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，恒压电泳约2 h。再以100 mA稳流转移至PVDF膜。用含5%脱脂奶粉的TTBS缓冲液封闭2 h，洗膜，加入小鼠抗人E-cadherin和Vimentin单克隆抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜。洗膜后，加辣根过氧化物酶结合的兔抗小鼠第二抗体(1∶1 000)，室温震荡孵育1 h，加增强型化学发光试剂发光，胶片经曝光、显影、定影和晾干后，进行图形处理及半定量分析。应用图形软件对特异性条带进行灰度扫描，以E-cadherin或Vimentin蛋白对β-actin蛋白的灰度比值作为蛋白的相对表达值。

1.8统计学分析应用SPSS16.0软件行t检验。

2结果

2.1二甲双胍抑制AGEs诱导的CRC细胞生长与对照组相比，AGEs处理能促进细胞的增殖，增加各个时间点的细胞活力。单独加入二甲双胍不影响细胞活力。然而，在AGEs预处理的细胞中，加入二甲双胍能显著抑制细胞活力(P<0.05)，见图1。

图1　二甲双胍抑制AGEs诱导的CRC细胞增殖

2.2二甲双胍对CRC细胞周期的影响SW480细胞与AGEs(100 μg/ml)和(或)二甲双胍(10 mmol/L)共同孵育24 h。AGEs处理降低G0/G1期比例，增加S期比例。二甲双胍增加AGEs预处理CRC细胞G0/G1期比例，减少S期比例(P<0.05)。然而，AGEs和二甲双胍均不影响G2/M期细胞的比例，见图2。

图2　二甲双胍抑制AGEs诱导的CRC细胞周期 阻滞于G 0/G 1期

2.3二甲双胍对CRC细胞凋亡的影响AGEs本身不会引起SW480细胞凋亡率的变化(凋亡指数，对照组7.46±1.14，AGEs组6.44±1.38)。然而，二甲双胍处理不仅增加SW480细胞凋亡(凋亡指数12.13±1.91)，也增加AGEs预处理的SW480细胞凋亡〔凋亡指数(25.27±4.00)〕(P<0.05)。此外，在AGEs预处理的SW480细胞，加入二甲双胍后显示了比单独二甲双胍处理更高的凋亡率。

2.4二甲双孤抑制AGE诱导的肿瘤侵袭和EMTAGEs可显著提高SW480细胞侵袭指数(AGE组：64.3±7.2，对照组：31.1±5.8)。二甲双胍处理能显著降低AGEs诱导的侵袭指数(35.0±4.3)。然而，与对照细胞相比，二甲双胍单独处理的SW480细胞没有显示侵袭指数的显著差异(24.9±4.5)。

免疫印迹结果显示，二甲双胍处理能显著抑制AGEs诱导的EMT，表现为E-cadherin蛋白表达增加，Vimentin蛋白表达降低。然而，与对照SW480细胞相比，二甲双胍单独处理对两个EMT标志蛋白的表达没有显著影响。见表1。

表1　二甲双胍抑制AGEs诱导的大肠癌细胞

与对照组比较：1)P<0.05；与AGEs组比较：2)P<0.05

3讨论

在这项研究中，我们发现二甲双胍对CRC细胞具有显著的抗肿瘤效应，能抑制AGEs预处理的SW480细胞增殖，诱导细胞周期阻滞在G0/G1期，并促进细胞凋亡。二甲双胍处理也能抑制肿瘤的侵袭和EMT，表现为上皮来源的E-cadherin蛋白表达增加和间质来源的Vimentin蛋白降低。

大量流行病学调查显示了糖尿病和CRC之间的正相关，糖尿病本身成为CRC发病的危险因素〔5〕。在无症状个体中，很多升高的糖代谢标志，如血糖水平、HOMA值、HbA1c和C肽水平以及代谢综合征，都与大肠腺瘤的流行呈显著正相关〔6〕。

AGEs是由还原糖，如葡萄糖与蛋白质、脂类和核酸的氨基基团形成的酶促反应形成产物。AGEs通过与相应受体RAGE结合而发挥促炎症反应作用。在正常人血液中可以检出可溶性RAGE，它们能与AGEs结合，从而避免与组织RAGE结合，起到保护作用。AGEs和RAGE在许多组织和细胞中表达，并与一些代谢性、神经退行性和炎症性疾病如糖尿病的发病相关〔7〕。最近，AGEs和RAGE被发现与一些肿瘤有关〔8〕。糖尿病患者CRC的发病率显著升高〔9〕。在男性吸烟者，高水平的血清可溶性RAGE与较低的CRC发病率相关〔10〕。AGEs能增强大鼠结肠黏膜 RAGE的表达，并促进肿瘤的发展〔11〕。因此在我们的实验中，我们把AGEs作为诱导剂体外处理细胞，发现AGEs能促进CRC细胞增殖，与其他作者最近报道AGEs通过提高碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)表达促进CRC细胞生长的结果相符合〔12〕。

二甲双胍广泛应用于治疗2型糖尿病〔13〕，能抑制能量敏感的AMPK/mTOR信号通路抑制蛋白质合成和细胞增殖〔14〕。二甲双胍显示了广泛的抗肿瘤效应，如抑制乳腺癌、卵巢癌、胃癌和前列腺癌的增殖〔15〕。我们的结果也显示了二甲双胍对CRC细胞的抑制增殖作用，其机制可能与二甲双胍诱导细胞周期阻滞和促进细胞凋亡有关。不仅如此，我们还发现，二甲双胍还能抑制CRC细胞侵袭和EMT过程。

CRC患者的死亡主要来自于癌细胞的侵袭和转移，原位癌细胞向转移性癌细胞转化是一个由上皮细胞向间质细胞分化的过程，伴随着细胞侵袭能力增强。而EMT是这个过程的关键环节〔16〕。二甲双胍在许多肿瘤中能抑制EMT过程〔17〕，其机制可能与二甲双胍激活的下游信号分子AMPK有关〔18〕。我们首次发现了二甲双胍抑制CRC细胞的EMT过程可能是其抑制CRC细胞侵袭的重要原因。

总之，二甲双胍能对AGEs诱导的CRC细胞发挥抗肿瘤效应，表现为抑制细胞增殖、诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡、抑制癌细胞侵袭和EMT。由于二甲双胍对AGEs预处理的CRC细胞显示了更强的抑制侵袭和EMT的作用，我们推测，二甲双胍对CRC的抗肿瘤效应可能是通过干扰AGEs在CRC细胞诱导的病理机制而起作用。应用二甲双胍将成为糖尿病相关CRC的一种治疗策略。

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〔2014-01-23修回〕

(编辑李相军)