慢性应激对大鼠海马神经细胞氧化损伤及Gli1蛋白表达的影响

慢性应激对大鼠海马神经细胞氧化损伤及Gli1蛋白表达的影响

常庚许晶张文娣牟真常翼

(大连医科大学附属第一医院神经内科,辽宁大连116011)

摘要〔〕目的探讨慢性应激导致大鼠海马神经细胞氧化损伤的病理机制。方法应用慢性轻度不可预见性应激建立抑郁症大鼠模型，随机分成对照组，模型组。用免疫组化法、流式细胞术分别检测海马神经元数目及凋亡率，用酶标仪检测乳酸脱氛酶(LDH)、丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量，用Western印迹法检测Gli1蛋白表达水平。结果慢性应激后，大鼠神经元数目较对照组明显减少，细胞凋亡率、LDH、MDA含量升高；与对照组相比，模型组中抗氧化酶SOD、GSH-Px含量明显降低，Gil1蛋白水平表达下调。结论慢性应激可能通过抑制Gli1蛋白表达诱导海马神经细胞的氧化损伤。

关键词〔〕抑郁症；慢性应激；细胞凋亡；氧化应激

中图分类号〔〕R741〔文献标识码〕A〔

通讯作者：许晶(1955-)，女，教授，博士生导师，主要从事认知与情绪障碍研究。

第一作者：常庚(1981-)，男，医学博士，主要从事神经系统疾病的基础与临床研究。

抑郁症是一种常见的情感性疾病，以情绪持久低落、思维迟缓、对工作失去兴趣等症状为特征。海马结构是哺乳动物的情感皮质下中枢，涉及了抑郁行为、情绪或心境改变的过程，在抑郁症的发病机制中发挥重要作用〔1〕。抑郁症发病过程中海马结构出现容积下降和明显的神经元凋亡，但其具体机制尚未阐明〔2〕。临床实验表明：抑郁症患者的血清中过氧化物及氧化标记物的含量高于正常人〔3〕，提示氧化应激是导致海马组织神经细胞变性凋亡的重要病理机制。Gli1蛋白是重要的抗氧化蛋白〔4〕，在神经细胞的抗氧化损伤中发挥重要作用。关于慢性应激对海马组织神经细胞Gli1蛋白表达的影响，目前尚未见报道。本实验应用慢性轻度不可预见的应激建立抑郁动物模型，通过检测海马神经细胞数目、凋亡率，乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量及Gli1蛋白的表达，以期深入探讨慢性应激导致海马神经细胞凋亡坏死的发病机制。

1材料与方法

1.1动物健康清洁级SD雄性大鼠50只，体重200～250 g，鼠龄4～6 w，由大连医科大学实验动物中心提供。除对照组外均单笼饲养，自然光照，通风良好，自由进食水。

1.2药品及试剂测定LDH 、MDA、SOD、GSH-Px含量的试剂均采用南京建成生物工程研究所。Gil1蛋白一抗购自 Cell Signal公司。免疫组化试剂一抗为小鼠抗非磷酸化神经丝单克隆抗体SMI32( Sternberger Monoclona公司)。

1.3模型建立按照文献〔5〕并略加改进，将2 h行为限制、4℃冰水中游泳5 min、停水24 h、停食24 h、夹尾1 min、明暗颠倒24 h、电击足底5 s(30 V电压)、摇晃5 min(160 Hz)、40℃环境5 min共9种刺激随机安排到18 d内，每日1种，每种刺激出现2次，同种刺激不能连续出现使动物不能预料刺激的发生。

1.4流式细胞仪检测细胞凋亡率实验结束后将动物断头处死，取海马组织制成单细胞悬液，应用流式细胞术检测海马神经细胞凋亡，操作步骤按说明书。

1.5脑组织生化测定实验结束后，断头取脑，并将海马组织制成10%的组织匀浆。严格按试剂盒说明测定脑组织中LDH、MDA、SOD、GSH-Px含量。以上指标测定用试剂均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测试完成，测试操作过程严格按照说明书进行。

1.6免疫组织化学方法检测海马神经元4%多聚甲醛固定40 min，0.13% Triton X-100浸透10 min，10%马血清封闭60 min，单克隆抗体SMI32摇床过夜，次日加生物素化马抗小鼠IgG 60 min，SABC 60 min，DAB 显色10 min，脱水、透明、封固。

1.7Gil1蛋白表达的检测采用Western印迹方法测定。以每个样品的总蛋白为200 μg进行上样，进行SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜至PVDF，脱脂奶粉封闭，一抗封闭4℃过夜，二抗37℃孵育1 h (羊抗兔)，漂洗后用增强化学发光法检测蛋白表达，自动扫描，进行灰度分析。

2结果

2.1海马神经细胞数目、凋亡率及海马组织中LDH的含量检测与对照组比较，模型组海马组织神经细胞数目明显减少(P<0.05)。见图1。应用流式细胞仪的研究发现，经过慢性应激干预后的海马神经细胞在细胞周期G1期前出现明显的凋亡峰，凋亡率为4.7%。与对照组比较，有统计学意义(P<0.05)。模型组的海马组织中LDH含量高于对照组(P<0.01)。见表1。

2.2慢性应激对海马组织中MDA、SOD及GSH-Px含量的影响模型组的海马组织中MDA含量高于对照组(P<0.01)。慢性应激可以明显降低SOD和GSH-Px的表达，模型组与对照组相比有显著差异(P<0.01)。见表1。

2.3慢性应激对Gli1信号蛋白表达的影响Gli1蛋白的表达见图2，模型组的海马组织中Gli1蛋白蛋白的表达高于对照组 (P<0.01)。

表1　慢性应激对LDH、MDA、SOD及GSH-Px含量的

与对照组比较：1)P<0.01

图1　慢性应激对海马组织神经细胞数目的影响(DAB，×20)

图2　慢性应激对海马组织Gli1蛋白的表达的影响

3讨论

抑郁症是一种常见的情感性疾病，因其高发病率、高自杀率，对社会和家庭造成了沉重的负担，引起了极大的关注。近年研究证实，抑郁症不仅是精神心理性疾病，更是与脑器质损害有关的神经疾病。抑郁症的发生与脑部情感相关中枢的结构及功能的损伤密切相关。皮质及皮质下核团和结构中，与情感密切相关的部位损伤均可能出现抑郁症状及性格行为的改变，特别是海马结构。动物实验证实：在海马结构破坏后，动物出现明显的情感、性格和认知变化。应激性生活事件是抑郁症的重要促发因素，其中慢性长期的不可预见的日常压力是引发抑郁的主要原因。慢性应激可以引起神经内分泌系统的功能变化，特别是氧化应激系统的激活。氧自由基引起的氧化损伤是脑部功能继发性损害的主要原因。

氧化应激是指体内的自由基及其产物超过机体的抗氧化防御机制的一种病理状态，它通常是由于体内的自由基显著增高和/或机体的抗氧化防御功能下降所致。机体内的自由基通过攻击膜蛋白质、核酸及生物膜上的不饱和脂肪酸，使之发生脂质过氧化反应，使膜结构遭到破坏、蛋白降解、核酸主链断裂、透明质酸解聚、细胞崩解、细胞结构和功能遭到破坏。本实验应用慢性不可预见的应激模拟造成抑郁症的压力源来制作抑郁动物模型，使大鼠出现抑郁症的临床症状。本研究显示，慢性应激导致了抑郁症模型鼠海马组织的神经细胞凋亡率上升，神经细胞数目减少；抑郁症模型鼠的海马组织中脂质过氧化物MDA含量显著增高，这与国外的研究是一致的。

我们进一步探讨抗氧化酶SOD、GSH在抑郁症大鼠海马组织中的变化。SOD和GSH是两种体内广泛存在的重要的过氧化物分解酶，能有效清除体内单线态氧、超氧阴离子、羟自由基等多种自由基，防治生物膜过氧化引起的损伤，是机体抗氧化防御机制之一〔6，7〕。我们的研究显示SOD、GSH活性显著低于正常对照组，提示在慢性应激进程中，脑组织存在着氧化抗氧化系统失衡的表现，这是导致神经细胞变性坏死的重要原因。

Gli1蛋白是重要的抗氧化蛋白，能有效激活Sonic Hedgehog(Shh)信号通路，上调多种抗氧化酶的表达水平，减轻氧自由基对细胞的损害以达到神经保护作用。我们的研究表明，慢性应激导致Gil1蛋白表达下降，可能是导致海马组织氧化损伤的重要机制。

我们的研究证实了，在慢性应激诱导的抑郁症大鼠海马组织中存在氧化损伤，不仅神经细胞数目明显减少，而且凋亡率明显增加。慢性应激导致海马神经细胞氧化损伤的机制在于：慢性应激减少了海马组织抗氧化酶的表达，下调了Gil1蛋白的表达。

4参考文献

1Eisch AJ，Petrik D.Depression and hippocampal neurogenesis：a road to remission〔J〕?Science，2012；338(6103)：72-5.

2Maes M，Yirmyia R，Noraberg J，etal.The inflammatory &Neurodegenerative (I&ND) hypothesis of depression：leads for future research and new drug developments in depression〔J〕.Metab Brain Dis，2009；24(1)：27-53.Yirmyia R，Noraberg J，etal.The inflammatory &Neurodegenerative (I&ND) hypothesis of depression：leads for future research and new drug developments in depression〔J〕.Metab Brain Dis，2009；24(1)：27-53.

3Maes M，Mihaylova I，Kubera M，etal.Increased plasma peroxides and serumoxidized lowdensity lipoprotein antibodies in major depression：markers that further explain the higher incidence of neurodegeneration and coronary artery disease〔J〕.J Affect Disord，2010；125(3)：287-94.

4Murua VS，Gomez RA，Andrea ME，etal.Shuttle-box deficits induced by chronic variable stress：reversal by imipramine administration〔J〕.Pharmacol Biochem Behav,1991；38(1)：125-30.

5许晶，李晓秋.慢性应激抑郁模型的建立及其评价〔J〕.中国行为医学科学,2003;12(1):14-7.

6陈珊，程熠，刘全超,等.氧化物歧化酶的生物学效应和在血管性疾病中的作用〔J〕.中国老年学杂志,2013:33(4):981-4.

7李昕，王建平，蒋超，等.黄体酮对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织SOD及MDA水平的影响〔J〕.中国老年学杂志,2012;32(16):3488-9.

〔2014-02-17修回〕

(编辑曹梦园)