电子烟烟气捕集液对CHO细胞相对增殖率的影响

（云南中烟工业有限责任公司，云南昆明650024）

电子烟烟气是通过电子烟雾化器加热电子烟烟油产生的如香烟一样的烟气。该烟气产生的原理和成分都与卷烟有着很大差别，因此对电子烟烟气的生物学效应进行评价十分必要。研究表明，电子烟烟气的主要成分有丙二醇、甘油、尼古丁、乙醛等一些易溶于水的化合物［1－2］，而目前关于电子烟烟气引起的生物学效应的报道比较少。鉴于此，作者采用细胞培养基对电子烟烟气的水溶性成分进行捕集，通过MTT 法研究电子烟烟气捕集液对体外培养的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的相对增殖率的影响，以期为电子烟研发提供参考。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

电子烟样品，自制。1＃～3＃电子烟样品的烟碱含量（mg·mL－1）分别为18、12、8；阴性对照为以灭菌蒸馏水为烟油的电子烟；阳性对照为肯塔基大学参比卷烟3R4F。

CHO 细胞，ATCC；DMEM／F12 培养基、胎牛血清，Gibco；MTT，Sigma。

SM450型20 孔道直线式吸烟机，CERULEAN；HFsafe－1500型二级生物安全柜；3111 型CO2培养箱，Thermo Forma；680型酶标仪，Bio－Rad。

1.2 方法

1.2.1 电子烟与3R4F的烟气捕集

将4.5 mL 不加血清的细胞培养基DMEM／F12加入已灭菌的“一种用于电子烟烟气生物学效应评价的烟气捕集装置”的烟气捕集瓶中，将直线式吸烟机烟气来路胶管紧密连接于捕集装置的烟气进气口上；将捕集瓶的烟气出口与吸烟机回路紧密连接；按照加拿大Labstat电子烟抽吸模式（抽吸容量55 mL，间隔30s，频率4s）设定自动吸烟程序［3］；每支电子烟抽吸100口，阴性对照抽吸100口，阳性对照3R4F 抽吸一支（电子烟是经雾化器对电子烟烟油进行雾化，不需要点燃，3R4F需要点燃）。

1.2.2 烟气浓度的设定

将收集到的电子烟烟气捕集液4.5mL 转移至离心管内，加入0.5mL 胎牛血清，设定其为100%烟气浓度（原液）；用含有10%胎牛血清的DMEM／F12细胞培养基将原液分别稀释至50%烟气浓度、25%烟气浓度、12.5%烟气浓度、6.25%烟气浓度。

将收集到的3R4F烟气捕集液按相同方法设定浓度［4］。

1.2.3 MTT 实验

将CHO 细胞在37 ℃、5%CO2培养箱中培养至细胞生长达到近汇合，且细胞处于指数分裂期。移除培养瓶中的培养基，加入适量胰蛋白酶溶液孵育约1 min，用细胞生长培养基悬起，形成单细胞悬浮液。用血球计数板进行细胞计数，计算每毫升细胞悬浮液中的活细胞数，用细胞生长培养基稀释细胞悬浮液，使CHO 细胞浓度达到0.8×105～1.2×105个·mL－1。将细胞悬浮液接种到96 孔细胞培养板中，每孔接种量为100μL，置于37℃、5%CO2培养箱内培养24h。

移除96 孔细胞培养板内的培养基，将200μL 烟气浓度分别为100%、50%、25%、12.5%和6.25%的烟气捕集液加入96孔板中，每个浓度设8个平行；置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养24h。按常规方法进行MTT 实验［5］，按下式计算细胞相对增殖率（relative growth rate，RGR）：

式中：ODn为样品组的多孔平均吸收值；OD0为空白对照组的多孔平均吸收值；ODc为阴性对照组的多孔平均吸收值。

1.2.4 数据分析

每个实验均重复3次，实验数据用均数±标准差（珚x±s）表示，结果采用SPSS13.0软件进行统计学分析，同一样品不同浓度之间差异比较采用单因素方差分析（one－way ANOVA）［6］，不同样品不同浓度之间差异采用独立样本T检验分析，以P＜0.05为有显著差异。

2 结果与讨论

2.1 电子烟和3R4F烟气捕集液浓度对CHO 细胞相对增殖率的影响（图1）

图1 烟气捕集液对CHO 细胞相对增殖率的影响Fig.1 Effect of cigratte smoke in cell culture medium on RGR of cell CHO

由图1可看出：1＃电子烟烟气捕集液6.25%烟气浓度时的细胞相对增殖率是100%烟气浓度时的1.42倍（图1a）；2＃电子烟烟气捕集液6.25%烟气浓度时的细胞相对增殖率是100%烟气浓度时的1.32倍（图1b）；3＃电子烟烟气捕集液6.25%烟气浓度时的细胞相对增殖率是100%烟气浓度时的1.27 倍（图1c）。可见，随着3种电子烟烟气稀释倍数的增大，CHO 细胞的相对增殖率均相应升高。

采用SPSS13.0软件对1＃、2＃、3＃电子烟烟气捕集液对CHO 细胞相对增殖率的影响进行统计学分析。结果发现，同一样品不同浓度之间存在显著差异（P＜0.05）。

由图1d可看出：随着3R4F 烟气稀释倍数的增大，CHO 细胞的相对增殖率相应升高；3R4F 烟气捕集液6.25%烟气浓度时的细胞相对增殖率是100%烟气浓度时的16.67倍。

采用SPSS13.0软件对3R4F烟气捕集液对CHO细胞相对增殖率的影响进行统计学分析。结果发现，同一样品不同浓度之间存在显著差异（P＜0.05）。

2.2 电子烟和3R4F烟气捕集液的CHO 细胞相对增殖率的比较（表1）

表1 电子烟和3R4F烟气捕集液的CHO 细胞相对增殖率的比较（珔x±s，n＝3）Tab.1 Comparison of RGR of cell CHO for electronic cigratte smoke and 3R4Fsmoke in cell culture medium（珔x±s，n＝3）

由表1 可知：3 种电子烟和3R4F 烟气捕集液对CHO 细胞相对增殖率的影响有显著差异（P＜0.05）；3种电子烟之间没有显著差异（P＞0.05）；在100%烟气浓度下，电子烟烟气捕集液的CHO 细胞相对增殖率是3R4F 的10 倍以上，其中，1＃为13.7 倍，2＃为14.6倍，3＃为15.2倍。

3 结论

在加拿大Labstat电子烟抽吸模式下，分别抽吸100口电子烟和一支3R4F，用4.5mL 的细胞培养基捕集烟气后染毒CHO 细胞进行MTT 实验。结果表明：抽吸一支3R4F的烟气捕集液对CHO 细胞相对增殖率的影响明显大于抽吸100口电子烟烟气捕集液产生的影响；在100%烟气浓度下，电子烟烟气捕集液的CHO 细胞相对增殖率是3R4F 的10倍以上。表明，该方法用于检测电子烟烟气捕集液对细胞相对增殖率的影响是可行的，可为电子烟研发提供参考。

［1］LEADBEATER J，LINDSAY J C.Technical review and analysis of FDA report：Evaluation of e－cigarettes［Z］.Technical Memorandum，2009－07－30.

［2］Materials characterization report［Z］.ANALYZE，2007－06－28.

［3］McAULEY T R，HOPKE P K，ZHAO J.Comparison of the effects of e－cigarette vapor and cigarette smoke on indoor air quality［J］.Inhalation Toxicology，2012，24（12）：850－857.

［4］ROMAGNA G，ALLIFRANCHINI E，BOCCHIETTO E，et al.Cytotoxicity evaluation of electronic cigarette vapor extract on cultured mammalian fibroblasts（ClearStream－LIFE）：Comparison with tobacco cigarette smoke extract［J］.Inhalation Toxicology，2013，25（6）：354－361.

［5］YQ／T 42－2013.烟草及烟草制品烟气安全性生物学评价MTT细胞毒性法［S］.

［6］王立芹，杨俊英，唐龙妹，等.单因素重复测量设计的方差分析及SAS与SPSS的实现［J］.华北煤炭医学院学报，2005，7（1）：17－19.