核酸适配体修饰的纳米脂质体的制备及靶向毒性研究

（苏州百拓生物技术服务有限公司，江苏苏州215123）

近年来，癌症的靶向治疗显示了巨大的应用前景。靶向治疗分为被动靶向和主动靶向，被动靶向主要是利用肿瘤新生血管通透性比普通血管高，纳米载体容易从这些部位渗漏到肿瘤部位，从而实现肿瘤部位的药物富集作用；主动靶向是在纳米载体的表面修饰一段能特异识别肿瘤细胞的抗体、肽、小分子等，使药物载体能特异识别并杀伤癌细胞［1］。脂质体是所有载体中应用最成功的，而且许多抗癌小分子脂质体药物（如吉西他滨、阿霉素、紫杉醇、顺铂、喜树碱等）已经实现了商业化［2］，但还存在着在体液环境中不稳定、药物未到达肿瘤部位就突然释放、肿瘤部位药物富集量少等缺点。为此，需要对脂质体进行进一步的修饰，抗体、肽、小分子等可作为细胞靶向识别配体修饰在脂质体上，以提高药物载体的特异识别能力。抗体通常对配体有很高的亲和力，但会引起很强的免疫反应；肽合成容易，不会引起很强的免疫反应，但易被体内的酶降解［3］；叶酸、乳糖酸等小分子虽然价格便宜，体内也稳定，但没有很强的靶向性［4－6］。聚乙二醇修饰能大大延长脂质体的血液循环时间、避免内皮系统的清除作用、提高药物在肿瘤部位的富集［7］。

适配体（aptamer）因独特的生物学特性已成为靶向治疗的热点。核酸适配体是短的DNA 或RNA 片段，一般由12～30个碱基构成，能特异识别目标分子，而且合成容易、修饰简单、储存和运输方便，在癌症诊疗中显示了巨大的应用前景，越来越多的研究用核酸适配体修饰脂质体，以进一步提高脂质体的治疗效果［8－12］。美国FDA 已于2004年批准了针对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的核酸适配体Pegaptanib用于老年眼睛黄斑病变的治疗［13］。核酸适配体AS1411是一段26个核苷酸的单链DNA 片段，富含鸟嘌呤，具有非常紧凑的结构和独特的生物学特性，能抵抗血液核酸酶的降解，能以很高的亲和力结合在癌细胞表面高表达核素蛋白（nucleolin），是第一个FDA 批准用于各种癌症临床治疗试验的适配体，Antisoma公司已完成了肾癌和急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AmL）的二期（phaseⅡa）临床研究，取得了不错的临床效果，现正等待审批进行下一期（phaseⅡb）临床研究［14－15］。

鉴于此，作者利用DSPE－PEG2000和核酸适配体修饰的DSPE－PEG5000（DSPE－PEG5000－Aptamer）自组装构建靶向载药体系（纳米脂质体），使修饰的核酸适配体充分暴露在载体表面，发挥识别细胞受体的作用，从而提高靶向性；并用乳腺癌细胞MCF－7（表面高表达核素蛋白）［16］检测该载药体系的靶向毒性。

1 实验

1.1 材料与仪器

DSPE－PEG2000（Mw2 700Da）、DSPE－PEG5000－COOH（Mw5 700Da），NanocsInc；1－乙基－3－（3－二甲基氨丙基）－碳化二亚胺（EDC）和N－羟基琥珀酰亚胺（NHS），Sigma－Aldrich；核酸适配体AS1411（100 μmol·mL－1），序列为FAM－5′－（GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG）－3′－NH2，5′端进行了FAM 荧光基团修饰，3′端进行了氨基修饰，由上海生工生物工程股份有限公司合成；盐酸阿霉素（DOX，Mw579Da），上海生工生物工程股份有限公司；人乳腺癌细胞MCF－7、非洲绿猴肾细胞Vero，自行保存；1640培养基、小牛血清，Gibco。

透析袋，Spectrum；WST 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒，碧云天；流式检测凋亡试剂盒Annexin－VFLUOS，Roche；旋转蒸发仪，上海申胜；探头式超声仪，宁波新芝；动态光散射仪，Malvern；荧光显微镜，Leica；FC－500型流式细胞仪，Beckman Coulter。

1.2 DSPE－PEG5000－Aptamer的合成

DSPE－PEG5000－COOH 通过EDC 交联，与核酸适配体AS1411反应，通过氨基和羧基形成酰胺键，从而把AS1411交联到DSPE－PEG5000－COOH 上，形成DSPE－PEG5000－Aptamer。合成路线如图1所示。

图1 DSPE－PEG5000－Aptamer的合成路线Fig.1 Synthetic route of DSPE－PEG5000－Aptamer

具体过程：按DSPE－PEG5000－COOH∶AS1411∶EDC∶NHS＝1∶1∶5∶1（物质的量比，下同）的比例取11.4 mg（2 μmol·L－1）的DSPE－PEG5000－COOH 溶于10mL PBS溶液（pH 值7.4，50mmol·L－1）中，加入10μmol·L－1的EDC，磁力搅拌0.5h，然后加入2μmol·L－1的NHS和AS1411，25 ℃反应16h后将反应物装入透析袋（截留分子量10 000）透析24h，除去未反应的物质，即得DSPE－PEG5000－Aptamer。将合成的 DSPE－PEG5000－Aptamer 用15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测，上样量15 μL，再用凝胶成像系统（Bio－Rad）检测。

1.3 纳米脂质体载药体系的构建

先用10mL氯仿溶解54 mg（20μmol·L－1）的DSPE－PEG2000，抽真空状态下55 ℃旋转蒸发4h，使其在瓶壁上形成脂膜；然后按DSPE－PEG2000∶DSPE－PEG5000－Aptamer∶盐酸阿霉素＝20∶1∶4的比例取5 mL PBS 溶液溶解的DSPE－PEG5000－Aptamer（0.2μmol·L－1），加入2.4 mg（4μmol·L－1）盐酸阿霉素，充分混匀后加入已成干膜的旋转蒸发瓶中；维持真空0.05MPa、温度55℃、转速180r·min－1旋转蒸发2h，使脂膜完全溶解在PBS溶液中，形成微红的乳液；乳液用超声仪冰浴超声（功率200 W，探头直径2mm，超声5s，间隔20s，共超声10次）后用250nm 的滤膜过滤，即得纳米脂质体。合成路线如图2所示。

图2 纳米脂质体载药体系的构建及细胞靶向识别示意图Fig.2 Construction of liposome nanocarrier target drug delivery system and scheme of targeted cells recognization

由于DSPE－PEG5000的分子量大，组装完成后可以使Aptamer充分暴露在载体表面，有利于和细胞表面的受体结合，通过受体介导的方式进入细胞而发挥药效。

用动态光散射仪检测纳米脂质体粒径分布。产物进行透析，收集透析液，按下式计算包封率：

1.4 载药体系对乳腺癌细胞MCF－7的靶向毒性

用MCF－7细胞检测载药体系的靶向毒性，以非洲绿猴肾细胞Vero为对照。将细胞培养于96孔板中，待细胞长满培养板70%左右，用PBS 溶液洗细胞3次，然后每孔加入无血清培养基100μL，培养2h，设计5个浓度梯度，每个浓度设3个重复孔。用于毒性实验的细胞孔先吸出10μL、15μL、20μL、25μL 和50μL的培养液，再分别加入10μL、15μL、20μL、25 μL和50μL的药物，使培养基的终体积为100μL，继续培养4h。每孔加入10μL WST 溶液，37 ℃孵育2h，测定450nm 处吸光度。

荧光显微镜检测载药体系进入细胞的情况：细胞培养于24孔板中，待细胞长满培养板70%左右，吸出培养基，用PBS 溶液洗3 次，加入0.5 mL 新鲜的1640培养基，培养2h，加入20μL药物孵育4h，用荧光显微镜观察。

流式细胞仪检测细胞的凋亡情况：待培养于6孔板的细胞长满培养板70%左右，加入40μL 药物孵育4h，PBS溶液洗3次，胰酶消化，用1.5mL PBS溶液重悬，2 000r·min－1离心3min，用1mL PBS溶液重悬细胞，使细胞浓度为1.5×106个·mL－1，加入5μL的Annexin－V－FLUOS和5μL 的PI染色液，孵育20 min，用流式细胞仪检测。

2 结果与讨论

2.1 DSPE－PEG5000－Aptamer的电泳图谱

由于Aptamer上带有FAM 基团，紫外照射下能发黄绿色的光。因此，用15%PAGE 对DSPEPEG5000－Aptamer进行电泳检测，结果见图3。

由图3可看出，由于Aptamer的交联，使DSPEPEG5000在凝胶中迁移受到阻滞（泳道1），而游离的Aptamer在凝胶中迁移较快（泳道2）。表明Aptamer成功交联到了DSPE－PEG5000上。

2.2 纳米脂质体的粒径分布及包封率

用动态光散射仪检测纳米脂质体的粒径分布，结果见图4。

图3 DSPE－PEG5000－Aptamer的电泳图谱Fig.3 Electrophorogram of DSPE－PEG5000－Aptamer

图4 纳米脂质体的粒径分布Fig.4 Particalsize distribution of liposome nanocarrier

由图4 可看出，纳米脂质体的平均粒径为130 nm。

以盐酸阿霉素浓度（c）为横坐标、OD550（A）为纵坐标绘制标准曲线（图5），拟合得到标准曲线方程：A＝0.01337c＋0.0014，R2＝0.99964。

图5 盐酸阿霉素的标准曲线Fig.5 Standard curve of doxorubicin hydrochloride

将纳米脂质体用透析袋透析后，收集透析液，测得550nm（盐酸阿霉素的最大吸收波长）处吸光度为0.095，由标准曲线方程得盐酸阿霉素浓度为7μg·mL－1，即透析液体系（100 mL）的盐酸阿霉素含量为700μg（0.7mg），据此计算包封率为70.8%。进一步算得载药体系中盐酸阿霉素的浓度为0.34 mg·mL－1。

2.3 载药体系进入细胞的情况（图6）

图6 载药体系在乳腺癌细胞MCF－7（a、b）及正常细胞Vero（c、d）中的荧光显微照片Fig.6 Fluorescence microscopy of drug delivery system in breast cancer cell MCF－7（a，b）and normal cell Vero（c，d）

由图6可看出，在乳腺癌细胞MCF－7（图6a、b）中有较强的黄绿荧光（FAM）和红色荧光（DOX），而在正常细胞Vero（图6c、d）中只能见到微弱的荧光，说明构建的载药体系对癌细胞有较强的靶向选择性。

2.4 细胞的凋亡情况

凋亡试剂Annexin－V－FLUOS主要针对细胞膜的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS），PS在细胞死亡和凋亡时从膜内外翻到膜外，与Annexin－V－FLUOS结合后发绿光，流式检测时为FL1绿光通道（激发波长488nm，发射波长533nm）；PI不能通过正常和早期凋亡的细胞膜，但是晚期和死亡的细胞由于膜受体破坏，PI能通过膜并与细胞核结合，发出红光，流式检测时为FL2红光通道（激发波长535nm，发射波长615nm）。

细胞经药物和凋亡试剂盒处理后，进行流式检测，结果见图7。

图7 乳腺癌细胞MCF－7（a）和正常细胞Vero（b）的凋亡情况Fig.7 Apoptosis of breast cancer cell MCF－7（a）and normal cell Vero（b）

由图7 可知，Vero 细胞经过药物处理4h 后，95.9%的细胞处于正常细胞象限E3，而乳腺癌细胞MCF－7的正常细胞降低到31.4%（A3象限），死亡细胞（A1 象限）为50.3%，死亡和凋亡的细胞（A2）为15.1%。

2.5 药物的细胞毒性

用WST 检测药物对乳腺癌细胞MCF－7 和正常细胞Vero的毒性，结果见图8。

由图8可知，药物对Vero细胞活性的影响较小，随着药物浓度的增加，细胞活性下降得比较缓慢；药物对MCF－7细胞活性影响较大，当药物浓度从6.8μg·mL－1（20μL）增加到8.5μg·mL－1（25μL）时，细胞活性急剧下降；当药物浓度继续增加到17μg·mL－1（50μL）时，细胞活性没有继续下降。表明8.5 μg·mL－1的盐酸阿霉素可以使一个6孔板的细胞（约1.5×106个）发生凋亡。

图8 药物对乳腺癌细胞MCF－7和正常细胞Vero的毒性Fig.8 Drug cytotoxicity on breast cancer cell MCF－7and normal cell Vero

3 结论

通过核酸适配体修饰，利用聚乙二醇化的DSPE自组装构建了纳米脂质体靶向载药体系，并进行了载药体系的靶向毒性研究，纳米脂质体的平均粒径为130nm，对盐酸阿霉素药物的包封率为70.8%。组装材料中DSPE－PEG5000的PEG 链比DSPE－PEG2000的长，可以使适配体充分暴露在载体表面，利于和癌细胞结合。载体具有体内被动靶向作用，即可以通过血液循环渗漏进入细胞间隙比较大的肿瘤新生血管，从而提高药物在肿瘤组织的富集浓度。另外，适配体的修饰进一步提高了载体对乳腺癌细胞的主动靶向性，提高了载体进入乳腺癌细胞的能力。研究表明，构建的载药体系对乳腺癌细胞MCF－7具有较好的靶向性，所使用的DSPE是FDA 已批准进入临床的材料，可以加快临床研究的转化，为开发乳腺癌的临床靶向治疗药物奠定了基础。

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