兔椎间失稳后弹性内固定软骨终板Ⅱ型胶原蛋白变化的实验研究

2015-12-28杨学军宋雄英邢文华霍洪军刘春杨

河北医科大学学报 2015年7期

关键词：内固定胶原

张　昭，杨学军，宋雄英，邢文华，霍洪军，刘春杨

(1.北京市丰台中西医结合医院骨伤科，北京 100072；2.内蒙古医科大学第二附属医院胸腰脊柱外科，内蒙古呼和浩特 010030)

兔椎间失稳后弹性内固定软骨终板Ⅱ型胶原蛋白变化的实验研究

张昭1，杨学军2*，宋雄英1，邢文华2，霍洪军2，刘春杨1

(1.北京市丰台中西医结合医院骨伤科，北京 100072；2.内蒙古医科大学第二附属医院胸腰脊柱外科，内蒙古呼和浩特 010030)

[摘要]目的观察兔软骨终板在椎间失稳环境下，经弹性内固定重建椎间稳定，软骨终板Ⅱ型胶原蛋白的变化，为腰腿痛疾病的治疗提供新的思路和方法。方法选取36只6个月龄日本大耳白兔,雄雌不限,体质量(2.5±0.15) kg，随机分为对照组和实验组各18只。先将实验所用36只兔制作成L6/7椎间手术失稳模型；实验组在手术失稳2个月后用椎弓根螺丝钉和张力钢丝弹性内固定的方法进行L6/7的稳定性重建，术后2、4、6个月分别取2组兔椎间盘软骨终板(每个时点6只)，用免疫组织化学的方法检测Ⅱ型胶原蛋白,用JD801图像分析系统进行图像分析,综合判断软骨终板的退行性变过程及机制。结果实验组手术进行椎间失稳张力钢丝弹性内固定稳定性重建后,2、4、6个月短期内椎间软骨终板厚度较对照组明显变厚，软骨细胞显著增加。实验组Ⅱ型胶原蛋白灰度术后2～6个月逐渐下降，实验组Ⅱ型胶原蛋白灰度术后2～6个月均低于对照组(P<0.01)；实验组Ⅱ型胶原蛋白光密度术后2～6个月逐渐升高，实验组Ⅱ型胶原蛋白光密度术后2～6个月均高于对照组(P<0.01)。结论弹性内固定能有效阻止软骨终板Ⅱ型胶原蛋白的退行性变；而且有部分恢复的征象,为进一步进行其他治疗创造了必要条件。

[关键词]椎间盘退行性变；软骨终板；胶原Ⅱ型；内固定

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.07.009

椎间盘软骨终板的退行性变受生物体内部因素和其所处周围外界因素影响，生物体在不同时间不同环境条件下，软骨终板的退行性变是不同的,传统的脊柱融合术一直是治疗脊柱椎间盘退行性变疾病的“金标准”，坚强的后路内固定和椎间融合会影响脊柱的活动度,同时会导致固定节段相邻椎间盘的退行性变加重，从而产生相应临床症状，脊柱内固定术后存在潜在的并发症[1]。关节失稳后的稳定性重建可阻止关节软骨的退行性变，明显缓解术后关节疼痛。椎间弹性内固定可有效治疗由椎间失稳引起的腰腿痛，也可有效缓解邻近节段椎间盘的退行性变[2]，并能适度保留椎体间的活动功能。为此，本实验手术咬去兔L6椎体的两侧下关节突，改变腰椎内部结构造成椎间失稳,用张力钢丝弹性内固定的方法重建椎间稳定性,观察椎间软骨终板Ⅱ型胶原蛋白的变化过程[3],现报告如下。

1材料与方法

1.1实验设计取36只6个月龄日本大耳白兔(由内蒙古农业大学动物中心提供),雄雌不限,平均体质量(2.50±0.15) kg，均在同样环境条件下喂养，随机分为实验组和对照组各18只。先将实验所用36只兔制备L6/7椎间手术失稳模型：刮除兔腰背部皮毛,用安定注射液1.25 mg/kg、氯胺酮0.02 g/kg、阿托品0.125 mg/kg依次一侧耳缘静脉注射麻醉后,俯卧固定于手术台上,消毒后铺无菌手术巾，取双侧平对髂嵴椎间隙(即L6/7)为中心,从正中切一长约4.5 cm纵行切口,切开皮肤及皮下组织,分离暴露棘突、双侧椎板及上下关节突，分离附着于棘突、椎板及小关节的肌肉等软组织,然后咬除L6/7棘上及棘间韧带,咬除L6椎体下位全部小关节突，造成兔椎间盘椎间失稳，用无菌生理盐水充分冲洗切口3次,依次缝合各层组织；碘伏消毒手术切口，术后各兔在自己单笼中自由活动。实验组18只兔在手术失稳2个月后用椎弓根螺丝钉和张力钢丝弹性内固定的方法进行L6/7的稳定性重建(图1，2)。将实验组和对照组动物在术后2、4、6个月分别取材，采用免疫组织化学的方法对所取椎间盘软骨终板Ⅱ型胶原蛋白进行制片检测,然后用JD801图像分析系统进行Ⅱ型胶原蛋白图像分析。

1.2试剂和设备APES防脱片剂(编号GLU-0048)、DAB显色试剂盒(编号DAB-0031/1031)、SP超敏试剂盒(编号Kit-9710/9720/9730)、抗人的胶原蛋白Ⅱ单克隆抗体(编号MAB-0222)由福州迈新生物技术开发有限公司生产；分析纯乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)由江苏捷达科技有限公司生产。JD801图像分析系统由江苏捷达科技有限公司生产；手提便携式X射线透视仪(BJI-1X型)/ BG-9000 C形臂X线机由德国产；HR-7751-M型微波炉由山东青岛海尔公司生产；医用手术器械一套;一次性无菌手术衣、无菌手术单及无菌手套；直径2 mm 长10 mm指骨用螺钉30×4个,直径0.9 mm医用钢丝3 m。

1.3操作方法

1.3.1取材用无菌注射器将25 mL空气沿实验兔耳缘静脉注射栓塞将其处死,用快骨刀快速切取完整L6/7椎间盘(保留部分软骨终板下松质骨)，放入中性甲醛溶液中固定,24 h后用15%EDTA溶液脱钙。

1.3.2脱钙将所取得的兔椎间盘软骨终板组织放入装有15% EDTA溶液的干净安瓿中,安瓿用用硫酸纸标记所放标本性质,安瓿用瓶盖封闭放入盛1 200 mL18 ℃左右自来水的塑料盆中,在微波炉中用中低两档加热10 min,然后换1 200 mL18 ℃左右自来水继续在微波炉中用中低两档加热10 min,自来水用来控制软骨终板组织脱钙时的温度始终控制在50℃以下,如此反复脱钙每日2 h后换15% EDTA溶液,置入37 ℃温箱中过夜,第2天再更换1次15% EDTA溶液，再按前一天方法进行微波脱钙,如此反复15 d左右，完整椎间盘可完成脱钙。

1.3.3制片载玻片清洁后用APES防脱片剂用丙酮50倍稀释后常规处理,盖玻片常规清洁处理。脱钙后将组织用自来水冲洗2次，其间5%无水硫酸钠饱和溶液浸泡，依次50%、70%、80%、95%(Ⅰ、Ⅱ)、100%(Ⅰ、Ⅱ)乙醇脱水，二甲苯透明，依次48～50 ℃、54～56 ℃、56～58 ℃软蜡渗蜡，石蜡包埋、修块、切片。

1.4Ⅱ型胶原蛋白的检测用UltrasensitiveTMSP超敏试剂盒检测按其说明书操作制片；JD801图像分析系统检测Ⅱ型胶原蛋白。

2结果

2.1软骨终板的变化椎间失稳(对照组)可导致椎间软骨终板在2～6个月短期内厚度明显变薄，软骨细胞显著减少(图3～5)；实验组手术进行椎间失稳张力钢丝弹性内固定稳定性重建后,在2～6个月短期内椎间软骨终板厚度较对照组明显变厚，软骨细胞显著增加(图6～8)。

2.2Ⅱ型胶原蛋白的变化对照组Ⅱ型胶原蛋白灰度术后2～6个月逐渐升高(P<0.01)，而实验组则逐渐下降(P<0.01)；实验组Ⅱ型胶原蛋白灰度术后2、4、6个月均低于对照组(P<0.01)。对照组Ⅱ型胶原蛋白光密度术后2～6个月缓慢降低(P<0.01)，而实验组Ⅱ型胶原蛋白光密度逐渐升高(P<0.01)；实验组Ⅱ型胶原蛋白光密度在术后2～6个月均高于对照组(P<0.01)。见表1。

表12组术后Ⅱ型胶原蛋白灰度和光密度比较

Table 1Comparison in gray scale and optical density of collagen typeⅡbetween two groups

组别Ⅱ型胶原蛋白灰度2个月4个月6个月FP对照组310.28±0.91313.21±1.30*315.68±0.77*#42.2810.000实验组290.28±0.87287.36±0.94*284.47±0.01*#40.2700.000t38.91339.47062.915P0.0000.0000.000组别Ⅱ型胶原蛋白光密度2个月4个月6个月FP对照组0.52±0.010.51±0.010.49±0.01*#14.0000.000实验组0.56±0.010.61±0.010.64±0.01*#98.0000.000t6.92817.32125.981P0.0000.0000.000

*P<0.01与2个月比较#P<0.01与4个月比较(q检验)

3讨论

颈肩痛、腰腿痛严重影响着人类的身体健康，而椎间盘的退行性变是导致颈肩痛、腰腿痛的主要原因。日前对椎间盘的退行性变过程及机制的认识有限,对构成椎间盘软骨终板的退行性变的认识更少,传统颈肩痛、腰腿痛均采用神经减压椎间盘摘除椎间融合术，给患者带来的负面影响是脊柱活动受限和邻近节段椎间盘退行性变加重。近年来随着分子生物学和基因技术等的临床应用，激发人类不断寻求干预椎间盘退行性变的新方法[4-8]。近期使用的脊柱弹性内固定系统(Bioflex、K-ROD、Dynesis、Coflex、人工椎间盘等)已取得了一定的临床疗效，但也存在一些不足；当前已有研究使用转基因及组织工程技术重建或修复椎间盘，利用重组DNA技术和基因克隆技术人工获得基因物质如骨形态蛋白、转化生长因子、血小板衍生生长因子等[9-10]，这些治疗因子仅在极短的一段时间内或只在某些特定环境条件下有效,始终不能达到预期效果[11-18]。为此，本研究应用张力钢丝弹性内固定重建椎间稳定的方法来观察椎间失稳后软骨终板退行性变的过程，国内亦曾有过相关报道[19-20]。

本研究结果显示：①正常结构的椎间盘及其周围组织是椎间盘正常代谢功能的基础，失稳状态的椎间盘各种代谢均处于失代偿状态。②椎间失稳(对照组)可导致椎间软骨终板在各实验时间点厚度明显变薄，软骨细胞显著减少，Ⅱ型胶原蛋白灰度术后2～6个月逐渐升高(P<0.01)，由于灰度值与阳性物质含量成反比，证明椎间失稳可导致椎间软骨终板Ⅱ型胶原蛋白的含量是逐渐减少的；同样对照组Ⅱ型胶原蛋白光密度术后2～6个月缓慢降低(P<0.01)，光密度与阳性物质的含量成正比，再次证明对照组可导致椎间软骨终板Ⅱ型胶原蛋白的含量是逐渐减少的[21]。由此可推测椎间盘在失稳状态下可直接影响软骨细胞的活性和数量，从而影响Ⅱ型胶原蛋白的含量，进而直接影响到椎间盘的新陈代谢、结构和功能。③手术进行椎间失稳张力钢丝弹性内固定稳定性重建后,在各实验时间点椎间软骨终板的厚度较对照组明显变厚，软骨细胞显著增加,而实验组Ⅱ型胶原蛋白灰度在2、4、6个月则是逐渐下降的(P<0.01)，Ⅱ型胶原蛋白光密度在2、4、6个月是逐渐升高的，不同时点间比较差异有统计学意义(P<0.01),证明实验组可导致椎间软骨终板Ⅱ型胶原蛋白的含量增加；实验组椎间软骨终板Ⅱ型胶原蛋白灰度在2、4、6个月均低于对照组，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，同样也证明弹性内固定能有效阻止椎间软骨终板的退行性变，可部分恢复退行性变的软骨终板结构。椎间失稳在短期内可能由于局部力学结构的改变导致椎间盘软骨终板机构和功能的改变，从而导致软骨终板Ⅱ型胶原蛋白明显减少。临床工作中积极预防椎体间失稳的出现可有效预防腰腿痛和颈肩痛的发生，椎间失稳后的椎间稳定性重建是有效的治疗方法，同时也是进行其他有效治疗的基础。

综上所述，椎间失稳是导致椎间软骨终板Ⅱ型胶原蛋白在短期内退行性变的主要原因；用张力钢丝弹性内固定的方法行椎间失稳后的稳定性重建，能有效阻止椎间软骨终板Ⅱ型胶原蛋白的退行性变,并能使退行性变的软骨终板Ⅱ型胶原蛋白得到部分恢复。(本文图见封二)

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