花椒多酚类化合物对卵巢摘除模型小鼠的抗抑郁作用

陈松芳，李立峰，陈静，王小同，黄汉津

（温州医科大学附属第二医院 神经内科，浙江 温州 325027）

·论 著·

花椒多酚类化合物对卵巢摘除模型小鼠的抗抑郁作用

陈松芳，李立峰，陈静，王小同，黄汉津

（温州医科大学附属第二医院 神经内科，浙江 温州 325027）

目的：探讨花椒多酚类化合物总提取物（ZPPC）对卵巢摘除模拟更年期的雌性ICR模型小鼠的抗抑郁作用及可能机制。方法：采用经典的行为绝望抗抑郁模型，即小鼠悬尾实验和强迫游泳实验。观察ZPPC对应激小鼠绝望不动时间的影响；同时观察ZPPC对小鼠自主活动的影响。采用荧光分光光度法测定ZPPC对小鼠脑内单胺氧化酶活性的影响。结果：与OVX组相比较，ZPPC（50、100、200 mg/kg）明显缩短小鼠悬尾和强迫游泳实验中的不动时间，其作用类似于阳性对照药氟西汀（10 mg/kg）；ZPPC还明显抑制脑内单胺氧化酶的活性。结论：ZPPC预给药在更年期小鼠行为绝望模型中显示出抗抑郁作用，其机制可能与抑制脑内单胺氧化酶活性有关。

花椒多酚类化合物；更年期抑郁；强迫游泳实验；单胺氧化酶活性

抑郁症是一种复杂的心境障碍性疾病，目前全世界约有12%～15%的人罹患本病[1]。研究发现更年期人群中抑郁症的发病率高达20%，占更年期综合征的78%，其主要的社会功能明显受到影响，并且围绝经期的妇女该症状的发生率及自杀率比同年龄的男性要高[2-3]。

目前关于抑郁症的发病机制，认为单胺类神经递质（5-羟色胺、去甲肾上腺素和多巴胺神经）在抑郁症的病因病理学中起着非常关键的作用，并在临床的抗抑郁药物治疗中得到了验证[4-5]。目前临床上使用的抗抑郁药一般是通过抑制单胺的代谢及单胺递质的重吸收而发挥其作用。但许多药物起效慢、不良反应明显。因此，从天然药物植物中开发出更具安全性、有效性、不良反应小的抗抑郁药逐渐成为这一领域的主要研究方向[6-7]。

花椒为芸香科植物（Zanthoxylum schinifolium Sieb）的成熟干燥果皮，其主要化学成分包括生物碱、酰胺、木脂素等[8]。有研究发现多种多酚类化合物，如小补心汤总黄酮多酚类[9]、姜黄素[10]等具有很好的抗抑郁作用。而花椒多酚类化合物总提取物（ZPPC）对更年期抑郁行为的影响鲜见报道。本实验建立卵巢摘除更年期模型，通过行为绝望抑郁动物的行为学改变及单胺氧化酶活性的影响，评估和筛查该药物的抗抑郁作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：本实验采用的是健康雌性ICR小鼠（由温州医科大学实验动物中心提供），体质量22～26 g，平均（24±1）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。所有动物适应环境3 d后进行手术，术前禁食水2～3 h。

1.1.2 药物：实验所用花椒购自四川九襄，经粉碎浸提（丙酮-水溶液7∶3）后，减压去除丙酮，再过滤残留的水分，经醋酸乙酯萃取分离，脱水烘干，即可得到黄棕色粉末状产物，即为ZPPC（获得率为0.033%），每次实验前需用双蒸水配成所需要浓度。氟西汀分散片（苏州礼来制药有限公司，规格为每粒0.02 g）。

1.1.3 实验仪器：DigBehv动物行为分析系统（上海吉量软件科技有限公司）、超纯水机：850EB超纯水系统（Millipore）、550型全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）、R-5000荧光分光光度计（日本岛津公司）、BIO-RAD全自动酶标仪550型（美国伯乐公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组：以随机法将48只雌性ICR小鼠分成假手术组（1组）、双侧卵巢切除（OVX）组（2组）、OVX+ZPPC 50 mg/kg组（3组）、OVX+ZPPC 100 mg/ kg组（4组）、OVX+ZPPC 200 mg/kg组（5组）、OVX+氟西汀10 mg/kg组（6组），每组8只，将以上动物饲养在本实验动物饲养中心，自由获得饮水及食物，定期换垫料。

1.2.2 卵巢摘除术：所有动物在适应环境3 d后进行双侧卵巢手术摘除。卵巢摘除术：10%的水合氯醛腹腔麻醉小鼠（5 mL/kg），取俯卧位皮洁后乙醇棉球消毒背部皮肤，在小鼠大腿根部稍上方水平，脊柱侧方不到1 cm处用眼科剪剪开一个与脊柱平行的长约5 mm皮肤切口，仔细剪开下方腰肌，仔细寻找包绕卵巢的脂肪组织见到粉红色的卵巢后将其拉出切口，在卵巢两侧结扎并摘除卵巢。假手术组不切除卵巢，仅摘取旁边少许脂肪组织。

1.2.3 小鼠阴道上皮角化实验：术后1周开始进行阴道上皮角化实验，其具体操作方法如下：左手抓住小鼠颈背部皮毛，右手持蘸有0.9%氯化钠溶液棉签，轻轻插入小鼠阴道，慢慢旋转，取出涂在载玻片上，以美兰溶液染色10 min，吹干后在显微镜下行细胞学观察，连续5 d未观察到角化细胞或仅有少量的角化细胞则表示去卵巢成功。阴道脱落细胞主要有3种，即白细胞、有核上皮细胞和角化细胞。当小鼠处于动情前期，涂片上绝大部分都是有核上皮细胞，基本很少见到角化细胞；随后卵泡的慢慢生长成熟，有核上皮细胞转化为无核角化细胞，表示进入动情期，此时在显微镜下观察时，可以看到几乎都是无核角化细胞以及很少的上皮细胞；最后在视野中可以发现白细胞，而无核角化细胞慢慢减少，此时3种细胞同时存在，说明已经进入动情后期。

1.2.4 给药方式：小鼠在手术恢复2周后开始按每日ZPPC 50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg及盐酸氟西汀10 mg/kg灌胃给药，对照组则给与同等体积的0.9%氯化钠溶液，所有组别的动物每天早上8∶00-11∶00给药1次，连续给药2周，末次给药1 h后对各组小鼠进行强迫游泳实验、悬尾实验和自主活动的测试。

1.2.5 小鼠强迫游泳实验：按Porsolt等[11]创建的方法，稍加改进。末次给药后1 h，将小鼠置于水温（25±1）℃、水深15 cm的游泳桶中游泳6 min，先适应2 min，记录后4 min小鼠累计的不动时间。小鼠被放进游泳桶中后会出现挣扎试图攀爬的行为，一段时间后便因失望而漂浮不动，当小鼠停止挣扎，浮在水中保持不动时开始记录，记录其累积不动时间。

1.2.6 小鼠悬尾实验：按Steru等[12]建立的方法，略加改进。末次给药后1 h，分别将小鼠尾部2 cm处的部分固定于自制的悬尾支架上，使小鼠处于悬挂状态，其头部离台面5 cm，小鼠倒挂时间为6 min，除去先适应的2 min，记录其后4 min的累积不动时间。当小鼠被倒挂于悬尾支架上后，小鼠头部开始上下左右活动，企图找到攀爬的地方，一段时间后因失望而活动次数减少，即出现间断性不动，记录其累积不动时间。

1.2.7 自主活动测试：将小鼠置于正方形开野实验箱为80 cm×80 cm×75 cm，底板用笔画成10 cm× 10 cm的方格。室内隔音，用视频记录小鼠活动行为，每只小鼠测试时间10 min，测试完成后用DigBehv动物行为分析系统进行测试结果分析。

1.2.8 小鼠脑内单胺氧化酶活性测定：完成上述实验后将小鼠立刻颈椎脱臼处死，断头取脑，在冰盘上分离脑组织，称质量后保存在-80 ℃冰箱中待行脑内单胺氧化酶活性测定。进行单胺氧化酶活性测定时，先把脑组织室温下解冻，在解冻后的脑组织中加入pH为7.8、浓度为0.05 mol/L的磷酸缓冲液4 mL，制成匀浆液；取0.2 mL组织匀浆液，在匀浆液中加入20%的曲通0.4 mL混合；再把上述混合液加入到2.5 mL的磷酸缓冲液中，溶液混匀后在38 ℃水箱中预孵育10 min，在反应液中加入30μL浓度为2.19 mmol/L底物（终浓度为22μmol/L），37℃水箱中预孵育30 min，在反应液中加入0.2 mL浓度为5 mol/L高氯酸溶液，冷却并离心（1 500×g，10 min），在0.5 mL上清液中加入浓度为1 mol/L氢氧化钠溶液2.5 mL。通过荧光分光光度计在激发光318 nm、发射光380 nm处测定产物4-氢喹啉的荧光强度。单胺氧化酶活性以nmol·30 min-1·mg protein-1表示。

1.3 统计学处理方法 所有数据采用SPSS16.0软件包进行分析。多个样本间计量资料比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐者采用LSD检验，方差不齐采用Dunnett’s T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZPPC对小鼠强迫游泳实验的影响 OVX+氟西汀10 mg/kg组及花椒多酚类化合物50、100、200 mg/kg 3个剂量组均能不同程度地缩短小鼠强迫游泳累积不动时间，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1A。与OVX组（2组）比较，其中OVX+ZPPC 50 mg/kg组（3组）、OVX+ZPPC 100 mg/kg组（4组）、OVX+ZPPC 200 mg/kg组（5组），分别缩短了9.15%、28.10%、35.94%，花椒多酚类化合物剂量与小鼠强迫游泳累积不动时间存在显著的负相关，有统计学意义（R=-0.951，P＜0.05），见图1B。

2.2 ZPPC对小鼠悬尾实验的影响 OVX+氟西汀10 mg/kg组、花椒多酚类化合物50、100、200 mg/kg 3个剂量给药均能明显缩短小鼠悬尾实验累积不动时间，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2A。同样，花椒多酚类化合物剂量与小鼠悬尾实验累积不动时间存在显著的负相关，有统计学意义（R= -0.989，P＜0.05），见图2B。

图1 ZPPC对小鼠强迫游泳实验的影响

图2 ZPPC对小鼠悬尾实验的影响

2.3 ZPPC对小鼠自发活动总路程的影响 发现给予花椒多酚类化合物50、100、200 mg/kg 3个剂量时，小鼠的运动总路程与空白组比较，差异没有统计学意义（P＞0.5），见表1。

2.4 ZPPC对小鼠脑内单胺氧化酶含量的影响 OVX+氟西汀10 mg/kg组和花椒多酚类化合物50、100、200 mg/kg 3个剂量对照组均显示小鼠脑内的单胺氧化酶的活性受到不同程度的抑制，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3A。进一步的相关性分析显示，两者的相关性无统计学意义（R=-0.942，P=0.058），见图3B。

表1 ZPPC对小鼠自发活动总路程的影响（n=8，±s，cm）

表1 ZPPC对小鼠自发活动总路程的影响（n=8，±s，cm）

组别 自发活动总路程假手术组 1 350.123±761.12 OVX组 1 454.430±754.25 OVX+ZPPC 50 mg/kg组 1 239.682±656.36 OVX+ZPPC 100 mg/kg组 1 682.488±692.28 OVX+ZPPC 200 mg/kg组 1 641.375±739.45 OVX+10 mg/kg氟西汀组 1 478.842±683.75

图3 ZPPC对小鼠脑内单胺氧化酶含量的影响

3 讨论

围绝经期是女性抑郁症的高发时期之一[13]。围绝经期目前为止仍没有统一的定义及诊断标准，结合公认一些文献，认为女性卵巢功能逐渐衰退到绝经后1年，故卵巢功能的退化是其前提条件。本实验以去卵巢建立绝经模型，并采用抗抑郁药物筛查经典动物模型：强迫游泳实验及悬尾实验，以此评估该药物抗抑郁效应。

强迫游泳实验是一种简便、易实施、具有良好信度和效度的抑郁症动物模型，主要被用来筛选具有潜在抗抑郁活性的药物[14]。在此模型后，又逐渐衍生出其他的一些行为绝望模型，其中较突出的是Steru等[12]在1985年创建的小鼠悬尾模型，上述模型动物均在开始一段时间“求生式”活动后，因失望而活动次数减少，出现间歇性不动，显示“绝望状态”。不动行为是在模型动物尝试了主动逃跑，但失败之后出现的适应性行为，被视为“抑郁状态”的指标[14]。

本实验给予去势后小鼠不同剂量的花椒多酚类化合物及阳性对照药物（氟西汀10 mg/kg），观察记录小鼠的行为模式和行为时间，来评估药物的抗抑郁作用。结果发现OVX组与假手术组比较，强迫游泳及悬尾实验的累积不动时间均有所增加，可能在手术组中由于切除了卵巢的小鼠雌激素分泌明显减少，对小鼠的累积不动时间有所影响，显示去势小鼠更加容易显现“绝望状态”，此与以往研究[13]相符。而OVX+ZPPC 50、100、200 mg/kg组和OVX+氟西汀10 mg/kg组的强迫游泳及悬尾实验的累积不动时间有明显缩短，说明3个不同剂量的ZPPC对小鼠的累积不动时间有不同程度缩短，并在一定剂量范围内存在相关性。其中ZPPC 200 mg/kg组作用效果与阳性对照药物相类似。提示ZPPC预给药具有一定的抗抑郁作用。然而，该作用需排除药物的假阳性结果，因为不少非抗抑郁的药物如皮层兴奋剂—咖啡因能够减少动物的不动时间，从而出现假阳性结果。所以在研究抗抑郁药物过程中，需要观察小鼠的自发活动来区分抗抑郁药和非抗抑郁药。本次实验中，通过DigBehv动物行为分析系统分析小鼠的自发行为，测量各组小鼠在开放场实验中的总路程，我们发现与假手术组及OVX组相比较，OVX+ZPPC 50、100、200 mg/kg组差异均无统计学意义，从而我们可以认为ZPPC对小鼠的自发行为不存在影响。因此，我们可以排除ZPPC对小鼠强迫游泳及悬尾实验的假阳性，从而认为它确实存在抗抑郁作用。

关于抑郁症的发病机制，主要包括单胺类递质失调假说、HPA轴过度激活学说、神经可塑性理论以及免疫损伤等各种学说。其中单胺类递质假说发展得较为成熟，抑制单胺氧化酶的活性，能够提高突触间隙单胺类神经递质的含量，进而达到抗抑郁的效果[15-16]。随后又有人员发现消耗单胺类神经递质，可导致临床一部分患者出现抑郁症状[17]。单胺假说的核心理念认为神经细胞突出间隙的单胺类神经递质5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺的相对与绝对不足是抑郁症发生的神经生化基础，也是目前大多数抗抑郁药的直接作用靶点。

对于更年期抑郁症的发生，1994年Schimdt等[18]首次提出了雌激素撤退假说，认为进入更年期的女性，卵巢功能逐渐减退导致雌激素分泌下降，而低雌激素状态可以促进抑郁症的发生或加重抑郁症的病情。张巍等[19]在研究更年期妇女抑郁症状与性激素关系时也发现，雌孕激素能够影响单胺氧化酶的变性和5-羟色胺的代谢，使其浓度发生改变。对于更年期抑郁症的发生，可能与突触后5-羟色胺的受体功能有密切关系，因为雌孕激素都有调节5-羟色胺受体表达的功能。随后的研究[20]发现，雌激素可以在基因水平上影响中枢神经递质系统，可以促进神经元的发育和神经突触的生长。本研究主要观察小鼠脑内单胺氧化酶活性的改变，结果发现：与假手术组比较，OVX组的单胺氧化酶活性有所升高，这可能与上文中提到的雌激素能加速单胺氧化酶的变性有关，与更年期抑郁症的雌激素撤退假说[18]也相符。另外，OVX+ZPPC 50、100、200 mg/kg组小鼠全脑内单胺氧化酶活性明显受抑制；因此，我们认为ZPPC预给药抗抑郁作用可能与抑制小鼠脑内单胺氧化酶活性有关。

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（本文编辑：吴彬）

The antidepressant effect of procyanidins extract from Zanthoxylum bungeanum Maxim on ovariectomized model mice

CHEN Songfang,LI Lifeng,CHEN Jing,WANG Xiaotong,HUANG Hanjin.Department of Neu-ology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Objective:To explore the antidepressant effect of chronic pre-administration with procyanidins extract from Zanthoxylum bungeanum Maxim (ZPPC) on ovariectomized model mice and its possible mechanism.Methods:The animals behavioral despair models of depression,including the tail suspension and forced wimming tests,were used to explore the antidepressant effects of ZPPC.The locomotor activity test was used to detect the change of locomotor activity.Meanwhile,the monoamine oxidase activity in the mouse brain was also determined.Results:The results showed that ZPPC (50,100,200 mg/kg) significantly reduced the duration of mmobility in both tail suspension and forced swimming tests.The effective doses did not alter locomotot activity,esembling the selectivity of the positive control drug fluoxetine (10 mg/kg) in relieving depression.Moreover,ZPPC was found to inhibit monoamine oxidase activity in the mouse brain.Conclusion:These findings suggest hat ZPPC exerts antidepressant effect in animals behavioral despair tests and the underlying mechanism may involve the central monoaminergic systems.

Zanthoxylum bungeanum Maxim; menopausal depression; forced swimming test; monoamine oxidase

R749.4

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.04.007

2014-11-04

温州市科技局科技计划项目（Y20100291）。

陈松芳（1974-），男，浙江温州人，主治医师，硕士。

黄汉津，主任医师，Email：hanjinhuang@163.com。