垂盆草提取物对TGF-β 1诱导的肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化和基质累积的影响

杨嫆嫆，陆红，吴莲凤，王斯璐，林成成，梁勇，白永恒（温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 3505，．医学检验中心；．外科实验室）

·论 著·

垂盆草提取物对TGF-β 1诱导的肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化和基质累积的影响

杨嫆嫆1，陆红1，吴莲凤1，王斯璐2，林成成2，梁勇2，白永恒2
（温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325015，1．医学检验中心；2．外科实验室）

目的：探讨垂盆草提取物（SSBE）对转化生长因子（TGF-β1）诱导的肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化（EMT）和基质累积的影响。方法：将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞系（NRK-52E）细胞分为只加入溶剂的对照组，只加入TGF-β1（浓度为5μg/L）的诱导组，以及加入SSBE（浓度为10和100 mg/L）和TGF-β1（浓度为5μg/L）的干预组。细胞形态变化采用倒置相差显微镜观察；细胞免疫荧光染色检测I I I型胶原、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和钙黏蛋白（E-cadherin）的表达；反转录聚合酶链反应检测α-SMA、骨形成蛋白-7（BMP-7）、紧密连接蛋白（Tjp1）、I型胶原（Col1a1）、I I I型胶原（Col3a1）、基质金属蛋白酶-2 （MMP-2）和抑制因子-2（TIMP-2）mRNA的表达。结果：TGF-β1作用后，NRK-52E细胞形态发生变化，形成了长梭状的肌成纤维细胞（MFs）；其上皮标志物E-cadherin和Tjp1的表达水平显著下降，而MFs标志物α-SMA表达显著增加；基质成分Col1a1和Col3a1的表达也明显增高。应用10和100 mg/L的SSBE干预后，抑制了TGF-β1诱导的细胞形态改变和α-SMA、Col1a1和Col3a1的高表达，并促进E-cadherin和Tjp1的表达。另外，SSBE也提高了BMP-7表达水平和MMP-2/TIMP-2比值。结论：SSBE可抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化样改变，而这一作用与其能有效阻止EMT进程和基质累积有关。

垂盆草提取物；转化生长因子-β1；上皮-间叶转分化；基质累积

肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞表型转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肾间质纤维化发生发展的关键环节[1]。在EMT过程中，小管细胞丧失了上皮细胞的标志，如钙黏蛋白（E-cadherin）等，形成了阳性表达α-平滑肌肌动蛋白α-SMA）的肌成纤维细胞（myofibroblasts，MFs）[2]。MFs是一种基质产生细胞，可分泌大量基质成分I型胶原（Col1a1）和I I I型胶原（Col3a1）在肾组织间隙累积从而导致纤维化的发生。抑制EMT进程，对防治肾间质纤维化具有十分重要的意义。垂盆草是一种景天科多年生草本植物，我们的前期研究显示，其提取物（Sedum sarmentosum Bunge extract，SSBE）可拮抗马兜铃酸所致的肾小管上皮细胞纤维化样改变[3]。这种抗纤维化作用，我们推测可能与SSBE抑制TGF-β 1的高表达密切相关。因此，本研究中我们拟采用TGF-β 1诱导肾小管上皮细胞（NRK-52E）出现EMT转变，来探讨SSBE对EMT和基质累积的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 SSBE，安徽宣城百草植物工贸公司；DMEM细胞培养液，美国Hyclone公司；胎牛血清，杭州四季青生物公司；胰蛋白酶和TRIzol提取液，美国Gibco公司；人重组TGF-β 1蛋白，美国PeproTech公司；Col3a1一抗，北京Bioss公司；α-SMA一抗，美国Santa Cruz公司；E-cadherin一抗，美国Abcam公司；荧光素（FITC）标记山羊抗兔IgG，北京康位生物公司；RT-PCR试剂，美国Promega公司。MyCycler梯度PCR仪，美国Bio-Rod公司；7500定量PCR仪，美国Applied Biosystems公司；Varioskan Flash全波长多功能扫描仪，美国Thermo Scien-tific公司；DM4000 B LED荧光正置显微镜，德国Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞：大鼠肾小管上皮细胞株（NRK-52E）购于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2.2 实验分组和细胞形态学观察：细胞培养前，按适当浓度接种于六孔板中，待融合到70%～80%时，换成无血清DMEM培养液并开始正式实验。①对照组：未加入SSBE或TGF-β 1；②诱导组：培养液中加入TGF-β 1（浓度为5μg/L）；③治疗组：培养液中同时加入SSBE和TGF-β 1（浓度为5μg/L），SSBE的浓度分别为10和100 mg/L。上述处理后的细胞置37 ℃和5% CO2的培养箱中培养，用倒置相差显微镜观察细胞形态变化。

1.2.3 real-time RT-PCR检测mRNA表达：采用Trizol试剂提取已处理细胞中的RNA，于260/280 nm测定吸光度值以确定样本纯度和浓度。根据试剂说明书将RNA反转录成cDNA。设计骨形成蛋白-7（BMP-7）、α-SMA、紧密连接蛋白（Tjp1）、基质金属蛋白酶2 （MMP-2）、基质金属蛋白酶组织抑制剂2（TIMP-2）、Col1a1和Col3a1 mRNA特异性引物，以β-actin作为内参对照（见表1），由上海捷瑞公司合成。取反转录产物1 μL进行PCR扩增，PCR扩增体系：5 μL 2×SYBR Green荧光定量试剂、2 μL引物（上、下游各1μL，终浓度200 nmol/L）、2μL反应缓冲液、1μL cDNA。扩增程序为：95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 35 s，40个循环。采用溶解曲线评价PCR结果可靠性，采用2-△△Ct计算相对mRNA表达量。△△Ct= [Ct目的基因（待测样品）-Ct内参（待测样品）]-[Ct目的基因（校正样品）-Ct内参（校正样品）]。

表1 扩增EMT和基质成分mRNA特异性引物

1.2.4 细胞免疫荧光染色检测EMT和基质成分相关分子的表达：将细胞经胰酶消化收集后分别以1× 105个细胞接种于含载玻片的六孔板中，细胞培养至70%融合后，分别用TGF-β 1和TGF-β 1联用SSBE进行处理24 h，用4%多聚甲醛固定30 min，0.3% Triton-X（1 mL/孔）破膜，室温20 min。0.5%正常山羊血清封闭。在各细胞爬片上滴加E-cadherin、α-SMA和Col3a1一抗工作液，4 ℃孵育过夜。滴加Dylight488（绿色）或594（红色）标记的二抗工作液，37 ℃孵育60 min。滴加DAPI于盖玻片上，室温染色5 min。细胞胞质绿色或红色和胞核蓝色为阳性着色。每组取3张片，每张片子取10个高倍视野，运用Image Pro Plus软件分析平均光密度值。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS15.0统计学软件。计量数据以±s表示，两组样本比较采用t检验和精确概率法，多组间样本比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SSBE抑制TGF-β1诱导NRK-52E细胞的形态改变

相差显微镜下，对照组NRK-52E细胞培养24 h后呈现铺路石状，细胞结合紧密，细胞间隙不明显（见图1）；5μg/L的TGF-β 1的诱导下，NRK-52E细胞呈梭形或不规则形状，细胞间隙拉大；在TGF-β 1基础上用10 mg/L的SSBE干预后，梭形细胞有所改善，细胞间隙缩小；当SSBE浓度增加到100 mg/L后，细胞形态恢复到铺路石状，细胞间隙减小，相互间结合紧密。这些结果提示SSBE抑制了TGF-β 1诱导的小管上皮细胞纤维样改变，并呈现浓度依赖性。

2.2 SSBE抑制TGF-β1诱导的EMT和基质累积 免疫荧光染色结果显示，5 μg/L TGF-β 1的作用下，NRK-52E细胞中上皮细胞标志物E-cadherin蛋白的表达水平明显下调，而MFs标志物α-SMA的表达水平明显升高，见图2。此外，TGF-β 1也促进了基质成分Col3a1蛋白的表达。Real-time RT-PCR结果显示，TGF-β 1抑制了紧密连接蛋白Tjp1 mRNA的表达，促进了α-SMA、Col1a1和Col3a1 mRNA的表达（见图3）。应用10和100 mg/L SSBE干预后，TGF-β 1诱导的这些EMT改变以及基质累积均被抑制，并且其抑制作用呈现浓度相关性。

图1 SSBE对TGF-β 1作用下NRK-52E细胞形态的影响（×200）

图2 SSBE对TGF-β 1作用下NRK-52E细胞EMT和胶原累积的影响（×200）

图3 SSBE对TGF-β 1诱导的EMT和基质累积相关基因表达的影响

2.3 SSBE逆转TGF-β1诱导的BMP-7高表达 以前研究显示，TGF-β 1诱导的EMT反应可被BMP-7所逆转，BMP-7表达下降可能是EMT形成重要的原因之一[4]。因此，我们评价了SSBE对BMP-7的影响。Real-time RT-PCR结果显示，在TGF-β 1作用后，NRK-52E细胞中BMP-7 mRNA的表达水平显著下调；而SSBE干预后，BMP-7 mRNA的表达水平恢复（见图4A）。

2.4 SSBE恢复TGF-β1诱导的MMP-2/TIMP-2失衡

MMP-2及TIMP-2是体内基质成分合成和降解重要的调节因素[5]。MMP-2/TIMP-2比例一旦降低，说明基质合成速度超过降解速度，导致基质累积和纤维化。本研究中，TGF-β 1虽同时上调了MMP-2和TIMP-2 mRNA表达水平，但上调TIMP-2 mRNA的程度高于MMP-2，从而导致其比例降低（见图4B-C）。而应用SSBE干预后，尽管MMP-2和TIMP-2 mRNA表达水平均下调，但TIMP-2 mRNA的表达水平下降更为严重。这些结果提示SSBE恢复了TGF-β 1诱导的MMP-2/TIMP-2失衡，从而改善基质成分累积程度。

图4 SSBE干预TGF-β1对BMP-7、MMP2和TIMP-2 mRNA表达的影响

3 讨论

根据功能学和形态学分类，可将肾组织分为上皮和间叶两种细胞类型，每一种都有其特有的功能。上皮细胞是多细胞结构，由紧密连接的细胞组成，并紧密黏附于基底膜表面。间叶细胞（主要为MFs）则为连接疏松的细胞，主要存在于细胞外基质，它们自己产生并有非常强的迁移能力。现今越来越多的证据证明上皮细胞能通过EMT改变其表型获得MFs的特征，使其增加移动和合成基质成分，如Col1a1 和Col3a1等[2]。EMT通常见于胚胎生长期组织形态形成和肿瘤的生长过程。然而，在恶劣或损伤微环境中，上皮细胞可以通过EMT，使其获得适应环境的表型，参与损伤后组织修复和纤维化[5]。在机体内，多种因素均可导致EMT的发生，如促纤维因子TGF-β 1表达的升高，BMP-7表达的下调等[6-7]。本实验中，我们应用TGF-β 1作用肾小管上皮细胞后，小管上皮细胞出现纤维样改变，NRK-52E细胞表达上皮细胞标志物E-cadherin和Tjp1减少，而表达MFs标志物α-SMA增多，基质成分Col1a1和Col3a1表达增加，这些结果提示TGF-β 1诱导了EMT的发生。应用SSBE干预后，小管上皮细胞EMT转变得到缓解，并且拮抗EMT作用的BMP-7表达也随之升高。因此，这些结果提示SSBE能拮抗TGF-β 1诱导的EMT和肾纤维化作用。

SSBE为垂盆草的回流提取物[8]，而后者属于景天科多年生草本植物，是中国药典记载的常用中药之一，具有清利湿热、解毒功效。考虑到SSBE是一种多组分的混合物，是否是由于其内组分的作用而影响其效应呢？我们前期通过高效液相色谱法测定其成分，发现SSBE中含有槲皮素、山萘酚、异鼠李素、木犀草素和异甘草素等，其中槲皮素含量最高。槲皮素又名栎精，具有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂等作用。此外，槲皮素也具有抗肿瘤和抗纤维化的作用，并且这种抗纤维化作用主要是通过调控MMP-2的表达来实现[9]。本研究中，我们也分析了SSBE对MMP-2及其抑制因子TIMP-2表达的影响。结果发现SSBE恢复了由于TGF-β 1所致的MMP-2/TIMP-2比值下调，说明SSBE抑制了MFs合成基质，促进其降解。基于上述证据，推测SSBE的抗纤维化作用可能与其主要组分槲皮素存在一定的相关性。

综上所述，我们从体外实验角度证实了SSBE能拮抗TGF-β 1诱导的EMT效应，抑制基质合成，促进降解，进而发挥抗肾纤维化作用。在未来的工作，我们将评价SSBE各组分对于小管上皮细胞EMT以及肾纤维化的作用，并且深入探索其可能的分子机制，为今后纤维化类疾病的中草药治疗提供理论依据。

[1] Liu Y.Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis [J].Nat Rev Nephrol,2011,7(12):684-696.

[2] Liu Y.New insights into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis[J].J Am Soc Nephrol,2010,21(2):212-222.

[3] Bai Y,Lu H,Hu L,et al.Effect of Sedum sarmentosum BUNGE extract on aristolochic acid-induced renal tubular epithelial cell injury[J].J Pharmacol Sci,2014,124(4):445-456.

[4] Xu Y,Wan J,Jiang D,et al.BMP-7 counteracts TGF-beta1-induced epithelial-to-mesenchymal transition in human renal proximal tubular epithelial cells[J].J Nephrol,2009,22(3):403-410.

[5] Anglani F,Ceol M,Mezzabotta F,et al.The renal stem cell system in kidney repair and regeneration[J].Front Biosci,2008,13:6395-6405.

[6] 胡丽萍,陆红,白永恒,等.小G蛋白Rac1在马兜铃酸诱导肾小管上皮细胞损伤中的作用及意义[J].温州医学院学报,2013,43(12):775-778.

[7] Lian YG,Zhou QG,Zhang YJ,et al.VEGF ameliorates tubulointerstitial fibrosis in unilateral ureteral obstruction mice via inhibition of epithelial-mesenchymal transition[J].Acta Pharmacol Sin,2011,32(12):1513-1521.

[8] Bai Y,Lu H,Zhang G,et al.Sedum sarmentosum Bunge extract exerts renal anti-fibrotic effects in vivo and in vitro[J].Life Sci,2014,105(1-2):22-30.

[9] Yoon JS,Chae MK,Jang SY,et al.Antifibrotic effects of quercetin in primary orbital fibroblasts and orbital fat tissue cultures of Graves’ orbitopathy[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2012,53(9):5921-5929.

（本文编辑：吴健敏）

Effect of Sedum sarmentosum Bunge Extract on TGF-β1-induced renal epithelial-to-mesenchymal transi- tion and matrix accumulation

YANG Rongrong1,LU Hong1,WU Lianfeng1,WANG Silu2,LIN Chengcheng2,LIANG Yong2,BAI Yongheng2.
1.Department of Laboratory Medicine,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 2.Wenzhou Key Laboratory of Surgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015

Objective:To investigate the protective effects of Sedum sarmentosum Bunge Extract (SSBE) on TGF-β1-induced epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and matrix accumulation in renal tubular epithelial cells (NRK-52E).Methods:NRK-52E cells were divided randomly into:control group treated with only solvent,TGF-β1 group treated with TGF-β1 at the concentrations with 5 µg/L and SSBE group treated with TGF-β1 plus SSBE at the concentrations with 10 and 100 mg/L.The morphology of the NRK-52E cells was observed under inverted/phase contrast microscope.Immunofluorescent analysis was performed to detect the expression of epithelial marker α-smooth muscle actin (α-SMA),mesenchymal marker E-cadherin,and matrix component type III collagen.Gene expression of α-SMA,bone morphogenic protein-7 (BMP-7),tight junction protein-1 (Tjp1),Col1a1,Col3a1,MMP-2,and TIMP-2 were also quantified by real-time RT-PCR.Results:In TGF-β-treated NRK-52E cells,fibrosis-like phonotype was obviously increased.TGF-β1 increased the expression of α-SMA,and decreased the expression of E-cadherin and Tjp1.Also,TGF-β1 enhanced the expression of type I and III collagens.Treatment with SSBE at the concentrations with 10 and 100 mg/L inhibited TGF-β1-induced fibrosislike phenotype of NRK-52E cells,accompanied with down-regulated expression of α-SMA,Col1a1 and Col1a1 and up-regulated expression of E-cadherin and Tip1.In addition,SSBE increased the expression of BMP-7 and the ratio between MMP-2 and TIMP-2.Conclusion:SSBE treatment reduce TGF-β1-induced fibrosis-like reaction in renal tubular epithelial cells through inhibiting EMT and matrix accumulation.

Sedum sarmentosum Bunge Extract; TGF-β1; epithelial-to-mesenchymal transition; matrix accumulation

R730.52

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.04.003

2014-09-11

浙江省自然科学基金资助项目（LQ12H05001）；温州市科技计划项目（Y20110028，Y20140023）。

杨嫆嫆（1961-），女，浙江乐清人，主管技师。

白永恒，主管技师，Email：greatsailor@163.com。