三个新的小鼠Pax-8剪接体的克隆及时空表达

宋丽娟，倪云杰，林振浩，侯良磊，吴漪皓，胡欢欢，黄晓燕，杨德业，（.温州医科大学附属第一医院 心内科，浙江 温州 3505；.杭州师范大学附属医院 心内科，浙江杭州 3005）

·论 著·

三个新的小鼠Pax-8剪接体的克隆及时空表达

宋丽娟1，倪云杰1，林振浩1，侯良磊1，吴漪皓1，胡欢欢1，黄晓燕2，杨德业1，2
（1.温州医科大学附属第一医院 心内科，浙江 温州 325015；2.杭州师范大学附属医院 心内科，浙江杭州 310015）

目的：转录因子Pax-8在胚胎发育及肿瘤发生中具有重要作用，本研究旨在克隆及鉴定小鼠Pax-8基因亚型，并检测其时空表达。方法：从野生型C57BL/6胎鼠的心脏中提取总RNA（Trizol法），反转录成cDNA，应用Q5超保真酶进行目的基因扩增，并克隆至真核表达质粒，进行酶切鉴定及测序鉴定。结果：在小鼠发育不同时期，除已知全长Pax-8a外，发现3个新的小鼠Pax-8选择性剪接体，分别命名为Pax-8b（第4外显子缺失）、Pax-8c（第4和第11外显子缺失）、Pax-8d（第4和第9外显子缺失）。结论：小鼠心脏中Pax-8存在四种选择性剪接体，且在不同发育时期差异表达。

Pax-8基因；剪接体；时空表达；克隆；小鼠

转录因子Pax-8属于成对盒基因家族，该家族共有9个成员，分别命名为Pax-1至Pax-9，其编码产物对胚胎时期组织器官的发育和分化有重要作用。Pax-8基因在肾脏和甲状腺表达较高，在其他器官如心脏、肺、小肠等也有少量表达[1]。Pax-8基因是成熟的甲状腺细胞生存和功能维持的必备条件，和甲状腺功能减退、甲状腺肿瘤、泌尿系统肿瘤、卵巢肿瘤等密切相关[2-6]。研究发现Pax-8基因敲除小鼠心脏呈球形，出现室间隔缺损，体外水平Pax-8可抑制心肌细胞凋亡，提示Pax-8基因可能通过心肌细胞凋亡通路而参与心脏发育过程[7-10]。

Kozmik等[11]发现人类Pax-8基因有多个剪接体，在人肾脏肿瘤细胞系中，Pax-8因第7和第8外显子丢失或存在而形成四种亚型，在人的胎盘中发现另2种亚型。Poleev等[12]发现不同的Pax-8剪接体形式可能参与了转录激活调控。然而，小鼠心脏发育过程中是否存在Pax-8不同亚型，及其功能的研究鲜见报道。因此，我们从不同发育阶段的C57BL/6小鼠心脏中克隆Pax-8基因，旨在研究Pax-8各亚型在心脏中的时空表达及其功能。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂 3个月龄C57BL/6雌雄小鼠购于杭州师范大学实验动物中心；pcDNA3.1（-）、引物、Trizol试剂、Lipofectamine 2000、琼脂糖购于Invitrogen；氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC水购于上海生工公司、4S Red Plus增强型安全核酸染色剂购于生工生物工程（上海）股份有限公司；Ta-KaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、rTaq酶、DNA ladder购自大连宝生物工程有限公司；NEB Q5超保真DNA聚合酶、限制性内切酶购自NEB公司；pGEM®-T Easy Vector Systems I购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；感受态细胞DH5a购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 心脏RNA提取及反转录 取雌雄小鼠各10只配笼，在母鼠怀孕13.5、15.5和17.5 d时，颈脱臼法处死，取出胚胎，分离胚胎心脏；分离出生12 h乳鼠的心脏。Trizol法提取心脏总RNA，反转录获得心脏cDNA。

1.3 Pax-8基因扩增及连接 扩增使用引物序列如下：F：5’-GATGCCTCACAACTCGATCAG-3’，R：5’-GTCCCCA TGACAACTACAGATGG-3’。反应条件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，循环34次；72 ℃ 5 min；4 ℃保持。PCR产物纯化加尾后与T-Easy载体连接、转化、小提。

1.4 重组Pax-8-pcDNA3.1（-）真核表达载体的构建 Not I酶切pcDNA3.1（-）载体与Pax-8-T Easy重组载体，酶切后的pcDNA3.1（-）载体经去磷酸化后再与Pax-8片段连接、转化，获得重组Pax-8-pcDNA3.1（-）真核表达载体。重组载体使用限制性内切酶BspE I与BamH I酶切鉴定插入方向。正向插入质粒送测序。

2 结果

2.1 不同胚胎发育时期心脏中Pax-8的克隆 各发育时期心脏RNA经反转录扩增后，得到多条不同长度剪接体片段（见图1）。在E13.5心脏中克隆出2条条带，长度分别约为1 400 bp和1 000 bp；在E15.5心脏中克隆出3条条带，长度约为1 400 bp、1 100 bp和1 000 bp；在E17.5心脏中克隆出2条条带，长度分别约1 400 bp和1 100 bp；出生12 h的乳鼠心脏中出现5条条带，长度分别约1 500 bp、1 400 bp、1 200 bp、1 100 bp及1 000 bp。

图1 不同胚胎发育时期心脏中Pax-8的表达

测序结果经BLAST比对（NM_011040.4），如图2所示，发现克隆所得约1 500 bp片段和1 400 bp片段相同，为小鼠全长Pax-8，命名为Pax-8a（1 374 bp）；长度约为1 200 bp的片段缺失Pax-8基因第4外显子，命名为Pax-8b（1 176 bp）；长度约为1 100 bp的片段缺失第4外显子和第11外显子，命名为Pax-8c （1 079 bp）；长度约为1 000 bp的片段缺失第4外显子和第9外显子，命名为Pax-8d（969 bp）。

2.2 各Pax-8亚型克隆和重组质粒载体构建 DNA片段与T-easy连接后，使用Not I酶切，然后与经Not I酶切去磷酸化的pcDNA3.1（-）进行连接。连接产物转化、小提，获得重组载体，经BspEI和BamHI双酶切结果显示插入的目的基因片段方向及大小正确（见图3），即Pax-8a-pcDNA3.1（-）全长6 851 bp，酶切获得1 060 bp和5 791 bp的两条片段；Pax-8b-pcDNA3.1（-）全长6 653 bp，酶切获得1 060 bp和5 593 bp两条片段；Pax-8c-pcDNA3.1（-）全长6 566 bp，酶切获得973 bp和5 593 bp两条片段；Pax-8d-pcDNA3.1（-）全长6 446 bp，酶切获得853 bp和5 593 bp两条条带。

3 讨论

Pax基因家族是一个古老的高度保守的家族，其编码产物为一组转录因子，在器官形成、分化过程中起重要作用。Pax-8是Pax基因家族一员，和组织器官的发育分化、功能维持、肿瘤发生发展等密切相关，在多个物种、多个器官中存在不同剪接体[13-14]。人的Pax-8基因含11个外显子，已有文献[11]报道的人肾脏肿瘤细胞来源的Pax-8有4个亚型，它们存在第7和/或第8外显子缺失，但都保留了Pax-8的成对结构域。小鼠Pax-8基因含12个外显子，本研究发现小鼠心脏中存在3个缺少第4外显子的Pax-8亚型，即Pax-8b、Pax-8c、Pax-8d，其中第3和第4外显子编码小鼠Pax-8成对结构域，提示这3种亚型可能影响Pax-8与其他基因、蛋白等的结合。

图2 Pax-8基因（NM_011040.4）外显子示意图及不同外显子缺失亚型测序结果（部分）。外显子4、9、11部分分别用红、绿、蓝下划线标示

图3 各重组Pax-8-pcDNA3.1（-）质粒经BspEI和BamHI双酶切电泳结果

在本实验所观察的时间点中，Pax-8a持续表达，而各亚型表达水平随发育进程而变化，提示Pax-8的不同剪接形式不仅参与了Pax-8 mRNA亚型的生成，还可能通过时空表达的变化参与小鼠心脏发育。这些剪接体对心脏发育的未知功能或作用，值得后期深入研究。

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（本文编辑：吴健敏）

Cloning of three newly-identified alternatively splicing isoforms of mouse Pax-8 and their spatial and tempo-ral expression patterns

S ONG Lijuan1,NI Yunjie1,LIN Zhenhao1,HOU Lianglei1,WU Yihao1,HU Huanhuan1,HUANG Xiaoyan2,YANG Deye1,2.
1.Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035; 2.Department of Cardiology,the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University,Hangzhou,310015

Objective:Pax-8 gene plays a pivotal role in embryonic development and tumorgenesis.This tudy aims to identify and clone different alternatively splicing isoforms of mouse Pax-8,and to detect their spaial and temporal expression patterns.Methods:Hearts from wild-type prenatal and postnatal mice of C57BL/6 background were carefully excised and total RNA was extracted using Trizol reagent.The cDNA fragment of Pax-8 was reverse transcribed and amplified by Q5 Taq polymerase and cloned into pcDNA3.1(-) vector.The recombinant vectors were validated by enzyme digestion and sequencing.Results:In comparison to their cognate ull-length Pax-8a,three alternatively splicing isoforms of mouse Pax-8,designated Pax-8b (exon4 deleted),Pax-8c (exon 4 and 11 deleted) and Pad-8d (exon 4 and 9 deleted),were identified in different periods of embryogenesis and successfully cloned.Conclusion:Mouse heart has four alternatively splicing isoforms of mouse Pax-8 that express in different spatial and temporal expression patterns.Such findings open a bright avenue for the urther functional study.

Pax-8 gene; alternatively splicing isoforms; spatial and temporal expression; cloning; mice

Q785

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.04.002

2014-12-23

国家自然科学基金资助项目（81270230）

宋丽娟（1989-），女，江西赣州人，硕士生。

杨德业，教授，博士生导师，Email：deyeyang@126.com。