红茶菌固定化发酵葛根茶饮料工艺研究

王润东，邵 伟

（1.湖北智慧果林业科技有限公司技术中心，湖北兴山443700；2.三峡大学生物与制药学院，湖北宜昌443001）

红茶菌固定化发酵葛根茶饮料工艺研究

王润东1，邵 伟2*

（1.湖北智慧果林业科技有限公司技术中心，湖北兴山443700；2.三峡大学生物与制药学院，湖北宜昌443001）

以葛根纤维提取物为原料进行红茶菌发酵，并以发酵茶中的总酸含量、总糖利用率和对发酵液的感官评价分作为评价指标，探讨了蔗糖添加量、接种量、揺瓶转速和发酵时间等因素对固定化细胞技术发酵葛根茶饮料的影响，并通过正交试验优化了发酵葛根茶饮料的最佳工艺条件。结果表明，蔗糖添加量为70 g/L，接种量为8%，揺瓶转速为180 r/min，发酵时间为7 d，所制得的发酵葛根茶饮料色泽均匀，酸甜可口。

葛根；红茶菌；固定化；发酵；饮料

葛根（Pueraria lobota）为藤本植物葛的块根，茎被稀疏的棕色长硬毛，是我国南方一些省区的一种药食两用植物，其味甘凉可口，常作煲汤之用。其主要成分是淀粉，此外还含有约12%的黄酮类化合物，包括大豆（黄豆）甙、大豆甙元、葛根素等10余种；并含有胡萝卜甙、氨基酸、香豆素类等[1-5]。葛根在提取完淀粉后，其葛根纤维渣多半丢弃，造成环境的污染，而其中也含有大量的有益成分，若能加以利用则有益于葛根产业的良性发展。

近年来，红茶菌饮料在世界各国都颇受欢迎，它主要由醋酸菌、乳酸菌等多种微生物共同对糖茶水进行发酵而成[6-10]。目前，红茶菌大都是采用静置培养的方式，这种方式易受杂菌污染，培养条件要求较高，菌种不宜保藏等。固定化技术是将酶或细胞固定于一定范围内，使它们既保持原有的活性，又可以在连续反应后回收并实现重复利用的一项技术[11]。同游离细胞相比，细胞经固定化后在单位体积内细胞浓度大幅度增加，提高发酵速率；其次，固定化细胞发酵性能稳定；再者，细胞固定后可以重复利用，对于生产胞外产品的发酵简化了细胞分离的步骤，节约了发酵过程的生产成本[12]。

本研究将葛根纤维渣中的有益成分进行抽提，以固定化细胞技术发酵葛根茶饮料，不仅可解决游离菌混合静置发酵生产红茶菌时存在的弊端，而且这种发酵方式有助于控制产品的质量，对葛根发酵茶饮料的开发具有一定的指导意义，从而为发酵葛根茶饮料的工业化生产提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葛根纤维渣：湖北智慧果林业科技发展有限公司；红茶菌：由三峡大学微生物实验室提供并保藏；白砂糖：市售。

海藻酸钠、明胶均为化学纯，其他试剂均为分析纯：国药集团药业股份有限公司。

红茶菌活化培养基的制备：蔗糖10 g，酵母膏10 g，碳酸钙15 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1 000 m L，pH 6.8，121℃灭菌20 min，培养基冷却至50℃左右，加入5%的无水乙醇。

发酵葛根茶饮料培养基的制备：将30g葛根纤维渣加入到1000m L沸水中，浸提60min，再将一定量的蔗糖（70g/L）加入到茶液中，混匀溶解，200目滤网过滤，得滤液，加水补足1 000m L，分装至三角瓶中，装液量为120 m L/250 m L，巴氏消毒（85℃、10 min），冷至室温备用。

1.2 仪器与设备

ALC-210.4型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；BXM-30R全自动立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯医疗器械有限公司；L550低速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；ZD85-1振荡培养器：苏州国华科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵葛根茶饮料加工工艺流程

1.3.2 操作要点

（1）固定化红茶菌细胞的制备[13]

将5.5%的海藻酸钠和1.5%的明胶充分溶解，灭菌后待其温度降至室温时，将培养好的红茶菌悬液与等体积的固定化载体溶液充分混匀，混匀后的红茶菌混合液用注射器滴入0.6%的氯化钙溶液中，得到固定化红茶菌细胞颗粒，固定1 h后用无菌水冲洗，重新加入0.6%的氯化钙溶液，4℃平衡过夜，备用。

（2）发酵葛根茶饮料的制备

按8%接种量向装液量为120 m L/250 m L的发酵葛根茶饮料培养基中接入固定化红茶菌细胞颗粒，30℃、180 r/min振荡培养7 d，发酵结束后，用200目滤网过滤发酵液，滤液装瓶后进行巴氏消毒（85℃、10 min），冷却后即为成品。

1.3.3 发酵工艺优化单因素试验

以总酸含量、总糖利用率及感官评分为考察指标，分别考察蔗糖添加量（50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L、90 g/L、100 g/L），接种量（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%），摇瓶转速（100 r/m in、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/m in、200 r/m in、220 r/m in），发酵时间（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h）等因素对发酵葛根茶饮料品质的影响。

1.3.4 固定化发酵工艺条件优化正交试验

在单因素试验的基础上，进行正交试验，选择蔗糖添加量（A）、接种量（B）、揺瓶转速（C）和发酵时间（D）等4个因素，每个因素选取3个水平，以感官评分为评价指标，按L9（34）正交表设计试验，因素与水平见表1。

表1 发酵工艺优化正交试验因素与水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

1.3.5 测定方法

在葛根茶饮料发酵过程中，每隔一天分别测定发酵液的总酸含量、总糖利用率，并对成品进行感官评价，以此分析各因素对葛根茶发酵饮料品质的影响。

（1）总酸的测定

采用国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中酸碱滴定法。

（2）总糖利用率的测定

采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定蔗糖含量[14]。总糖利用率计算公式如下：

（3）发酵葛根茶饮料感官评价[15]

组织10人为感官评价小组，根据表2的评价标准，对不同产品的色泽、风味进行鉴定并打分，满分为4分，以感官评分平均值作为最终的感官评价结果。

表2 发酵葛根茶饮料感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of fermentation kudzu root beverage

2 结果与分析

2.1 蔗糖添加量对发酵葛根茶饮料的影响

由图1可知，随着蔗糖添加量的增加，发酵液的总糖利用率呈现先升后降的趋势，当蔗糖添加量为80 g/L时，发酵液的总糖利用率最大，而随着蔗糖添加量的增加，发酵液中的总酸含量总体呈现下降的趋势，由此可见蔗糖添加量越大，对红茶菌的抑制作用越强，总酸含量越低。因此，初步确定发酵葛根茶饮料培养基中蔗糖添加量为60～90 g/L。

图1 蔗糖添加量对总酸含量和总糖利用率的影响Fig.1 Effect of sucrose addition on total acid content and total sugar utilization

表3 蔗糖添加量对感官评分的影响Table 3 Effect of sucrose addition on sensory evaluation score

由表3可知，随着蔗糖添加量的增加，感官评分呈现先升后降的趋势，这是因为蔗糖添加量过低或过高，会导致发酵液偏酸或偏甜，而当蔗糖添加量为70～80 g/L时，发酵液酸甜可口，感官评价分值最高。

2.2 接种量对发酵葛根茶饮料的影响

图2 接种量对总酸含量和总糖利用率的影响Fig.2 Effect of inoculum on total acid content and total sugar utilization

由图2可知，随着接种量的增加，发酵液的总酸含量和总糖利用率均不断增加，但接种量在10%～15%时发酵液的总酸含量差别不大，这是由于接种量过大时，醋酸菌会大量消耗发酵液中的营养物质用于其自身的生长、繁殖，并代谢大量的废物。同时，接种量＞10%时，发酵液中总酸含量过大，影响发酵液品质，而接种量为2.5%时，发酵不彻底，发酵液的总酸含量仅为5.43 g/L，这说明接种量过高或过低，都不利于葛根茶饮料的发酵。因此，初步确定接种量为6%～10%。

表4 接种量对感官评分的影响Table 4 Effect of inoculum on sensory evaluation score

由表4可知，随着接种量的增加，感官评价分值呈现先升后降的趋势，当接种量为8%时，感官评分最高，这说明8%的接种量有益于发酵葛根茶饮料的品质。

图3 摇瓶转速对总酸含量和总糖利用率的影响Fig.3 Effect of shaking speed on total acid content and total sugar utilization

2.3 摇瓶转速对发酵葛根茶饮料的影响

由图3可见，随着摇瓶转速的增加，发酵液的总酸含量和总糖利用率均不断提高，这是由于转速的提高有利于氧在发酵液中的溶解，使发酵液中的糖分更易于转化为醋酸，但转速达到200 r/min后，其对溶氧的贡献达到了极限，出现了发酵液中总酸含量和总糖利用率增加缓慢的现象，这说明一定的摇瓶转速对葛根茶饮料的发酵是有益的。因此，初步确定摇瓶转速为140～200 r/min。

表5 摇瓶转速对感官评分的影响Table 5 Effect of shaking speed on sensory evaluation score

由表5可知，随着摇瓶转速的增加，感官评价分值呈现先升后降的趋势，当摇瓶转速为180 r/min时，感官评价分最高，这说明采用180 r/min的摇瓶转速制得的发酵葛根茶饮料品质较好。

2.4 发酵时间对发酵葛根茶饮料的影响

由图4可知，随着发酵进行，发酵液中总酸含量和总糖利用率随发酵时间的延长均呈同步增长趋势，这是因为发酵葛根茶饮料中的红茶菌生长繁殖不仅需要消耗糖类物质，而且乙酸、乙醇等产物的生成也需要通过糖类物质的转化。到发酵的第7天时，发酵液中总酸含量为14.2g/L。因此，初步确定摇瓶发酵时间为6～8 d。

图4 发酵时间对总酸含量和总糖利用率的影响Fig.4 Effect of fermentation time on total acid content and total sugar utilization

表6 发酵时间对感官评分的影响Tab le 6 Effect of fermentation time on sensory evaluation score

由表6可知，发酵时间过短或过长时，感官评分偏低，发酵液品质不佳，当发酵时间为7 d时，感官评价分值最高，发酵液品质较好。

2.5 葛根茶饮料发酵工艺条件优化

在单因素试验结果的基础上，采用正交设计试验对发酵条件进行优化，正交试验结果与分析见表7。

表7 发酵工艺优化正交试验结果与分析Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

从表7可知，所选的4个因素对葛根茶饮料发酵的影响依次为发酵时间＞接种量＞摇瓶转速＞蔗糖添加量。通过极差分析可知，最佳工艺条件为A1B2C3D2，即蔗糖添加量为70 g/L，接种量为8%，摇瓶转速180 r/min，发酵时间为7 d。在此条件下进行验证试验，发酵葛根茶饮料的感官评分为3.5分，产品色泽均匀，酸甜可口，具有葛根发酵茶发酵液特有的风味。

3 结论

以葛根纤维提取物为原料，利用固定化细胞技术实现了葛根茶饮料的固定化发酵，结果表明，通过单因素和正交试验得出固定化发酵葛根茶饮料的最佳工艺条件为蔗糖添加量70 g/L，接种量8%，摇瓶转速180 r/m in，发酵时间为7 d。在此条件制备的发酵葛根茶饮料色泽均匀，酸甜可口。

[1]黄筑艳，赵延涛，李焱.葛根药理及临床研究进展[J].光明中医，2007，22（6）：63-67.

[2]程江华，王灼琛，董万领，等.葛根植物饮料中试生产过程中总黄酮含量变化研究[J].中国酿造，2013，32（7）：98-100.

[3]彭游，胡小铭.葛根黄酮提取与保健功能研究进展[J].食品工业科技，2011，32（12）：581-589.

[4]王端，周鸿翔，田娅玲，等.微波辅助提取葛根黄酮的工艺研究[J].中国酿造，2013，33（3）：81-86.

[5]郑建仙.功能性食品[M].北京：中国轻工业出版社，1992.

[6]宋清鹏，胡卓炎，刘丹.红茶菌饮料的研究进展[J].包装与食品机械，2013，31（3）：44-48.

[7]李培睿，张晓伟.红茶菌研究进展[J].许昌学院学报，2014，33（5）：79-81.

[8]王冬梅，姬鄂豫，郭书贤.系列红茶菌饮料抗氧化活性的研究[J].食品工业，2013，34（8）：34-36.

[9]孙协军，宋立.红茶菌发酵工艺优化及菌液主要成分变化分析[J].食品与发酵科技，2013，49（5）：87-90.

[10]赵文红，肖燕清，白卫东，等.红茶菌饮料的研制[J].中国酿造，2009，28（4）：182-186.

[11]何玥，林庆胜，郝卫宁，等.生物固定化技术及其应用研究进展[J].生物技术通报，2009（S1）：88-93.

[12]KOURKOUTAS Y,BEKATOROU A,BANAT IM,et al.Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages production:a review[J].Food Microbiol,2004,21(4):377-397.

[13]任二芳，麻少莹，黄夏，等.海藻酸钠-明胶协同固定化红茶菌制备工艺的优化[J].南方农业学报，2013，44（7）：1178-1183.

[14]华南理工大学等.食品分析[M].北京：中国轻工业出版社，1994.

[15]任二芳.固定化共生发酵红茶菌饮料的研究[D].南宁：广西大学硕士论文，2013.

Preparation process of kudzu root beverage by immobilized kombucha fermentation

WANG Rundong1,SHAO Wei2*
(1.Technology Center of Hubei Wisdom Fruit Forestry Science and Technology Co.,Ltd.,Xingshan 443700,China; 2.College of Biological and Pharmaceutical Sciences,China Three Gorges University,Yichang 443001,China)

Using kudzu root fibers extract as raw materials to conduct fermentation,and the total acid content,total sugar utilization and sensory evaluation on fermentation liquor as evaluation index,the effects of sucrose concentration,inoculum,shaken bottle speed and fermentation time on kudzu root beverage by immobilized cell fermentation was discussed.The processing conditions of kudzu root beverage were optimized by orthogonal experiment as follows:sucrose concentration 70 g/L,inoculum 8%,shaken bottle speed 180 r/min,and fermentation time 7 d.The product had uniform color and distinctive flavor.

kudzu root;kombucha;immobilization;fermentation;beverage

TS261.7

A

0254-5071（2015）03-0158-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.038

2015-02-09

三峡大学生物与制药学院2013年资助项目（2014HY 005）

王润东（1987-），男，助理工程师，本科，主要从事食品开发与研究工作。

*通讯作者：邵伟（1966-），男，高级实验师，硕士，主要从事微生物学教学及研究工作。