高效液相色谱法测定黑莓果汁及黑莓啤酒中的γ-氨基丁酸

胡雪莲，王宏华，王莉娜

（北京燕京啤酒集团公司技术中心，啤酒酿造技术北京市重点实验室，北京101300）

高效液相色谱法测定黑莓果汁及黑莓啤酒中的γ-氨基丁酸

胡雪莲，王宏华，王莉娜

（北京燕京啤酒集团公司技术中心，啤酒酿造技术北京市重点实验室，北京101300）

建立了一种黑莓果汁及黑莓啤酒中测定γ-氨基丁酸的高效液相色谱法。采用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)为柱前衍生试剂，色谱柱为Waters AccQoTagTM氨基酸分析柱，梯度洗脱，紫外检测波长248 nm。结果表明γ-氨基丁酸线性方程为y=21 012x+155 852，在1～1 000 mg/L范围内呈现良好线性关系，相关系数R2=0.999 4，综合黑莓原汁、浓缩汁及黑莓啤酒样品的结果，加标回收率为87.9%～114.9%，相对标准偏差为2.7%～12.3%，检出限为0.7 mg/L。采用此法检测黑莓果汁及黑莓啤酒中的γ-氨基丁酸方法简便易行，结果稳定性好。

6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯；柱前衍生；高效液相色谱；γ-氨基丁酸；黑莓果汁；黑莓啤酒

黑莓是新兴的浆果类水果[1]，除少部分直接鲜食外，大部分用于加工制成果汁、果酱、速冻干果等食品[2]。黑莓富含维生素、粗蛋白、糖、超氧化物歧化酶及硒等多种有益元素，黑莓中的氨基酸含量较高，并且富含γ-氨基丁酸[3]。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）又称氨酪酸，是一种非蛋白质天然氨基酸，为哺乳动物中枢神经系统一种重要的抑制性神经递质[4]，已有研究表明，GABA具有激活脑内葡萄糖代谢、促进乙酰胆碱合成、降血氨、抗惊厥、降血压、恢复脑细胞的功能等多种药理作用[5]。GABA作为一种新型的功能食品因子，已经广泛的应用于饮料、果酱、糕点、饼干、调味品等制品中[6]。啤酒是一种深受广大消费者喜爱的低酒精度饮料，如能将黑莓与啤酒的酿造过程有机结合而研制出黑莓啤酒，既能保持啤酒的固有风格，又能突出黑莓的独特口味而使啤酒具有一定的保健功能，将为黑莓的深加工找到一条新路，也将极大地丰富啤酒的花色品种，满足各层次消费者的需求。

目前国内外对GABA测定的方法主要有酶法、毛细管电泳法、纸层析法、比色法、气相色谱法、液相色谱法[7-12]等。随着色谱技术的发展，高效液相色谱法因其样品预处理简单，方法准确度、精密度及灵敏度较高，在测定食品的应用中日益广泛。目前已有对三七地上部分[13]、南瓜叶[14]和红茶[15]中γ-氨基丁酸含量测定的相关报道。本研究采用6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（6-aminoquinoline-N-hydroxysuccinimido carbamate，AQC）作衍生试剂，对黑莓果汁及黑莓啤酒中γ-氨基丁酸的含量进行测定。衍生产物中的喹啉基团是提高检测灵敏度的关键，生成在室温条件下可稳定一周的高稳定性的脲，衍生物经高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分离后经紫外检测器检测，可得到理想的结果。本实验建立了黑莓果汁及黑莓啤酒中γ-氨基丁酸高效液相色谱分析方法，为黑莓啤酒的进一步研究提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑莓原汁、黑莓浓缩汁：市售；试验酒：燕京小试开发黑莓啤酒。

γ-氨基丁酸标准样品：美国Sigma公司；乙腈（色谱级）：美国Fisher公司；AccQ·FlourTM衍生试剂盒（1硼酸盐缓冲液；2B稀释液；2A衍生试剂粉末）、AccQ·Tag流动相A浓液：美国Waters公司；Milli-Q超纯水：德国Merck Millipore公司；85%磷酸（分析纯）：北京化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

Waters 2489液相色谱仪（真空脱气器、四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器）：美国Waters公司；MVS-1型旋涡混合器：北京金北德工贸有限公司；Eppendorf Centrifuge 5430R离心机：德国Eppendorf艾本德公司；101-3EBS型电热鼓风干燥箱：北京光明医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 衍生试剂的配制

AccQ·FLourTM试剂盒中的2A瓶，装有称量好的的衍生剂粉末，用乙腈配制后即得10 mmol/L的AccQ·FLourTM衍生试剂。配制方法如下：将干燥箱预热至55℃；吸取1 m L 2B稀释剂放入2A瓶中，加盖密封；摇荡10 s；置干燥箱中加热，至衍生剂粉末全部溶解。加热时间一般需要30 m in，若有不溶物，可适当延长加热时间，备用。

1.3.2 样品处理

黑莓果汁：将黑莓果汁摇匀，倒入离心管中，于6 000 r/min的条件下离心10m in，取上清液，经0.2μm滤膜过滤后备用。取10 μL滤液至干净的6 mm×50 mm样品衍生管底部，吸取70 μL硼酸盐缓冲液（pH值为8.8）至样品管中，涡旋混合，再吸取20 μL AQC衍生试剂到样品管中，立即涡旋混匀10 s，室温放置1 m in；用石蜡膜封口，置55℃干燥箱内加热10min，取出转移至样品瓶中，10μL进样，供HPLC分析。

黑莓浓缩汁：需用水稀释10倍，其他处理同上。

黑莓啤酒：取50 m L样品用折叠滤纸过滤除气，再用0.2 μm滤膜过滤备用。其他处理同上。

1.3.3 标准溶液的制备

准确称取100 mgγ-氨基丁酸标准物质至100 m L容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容，配制成1 000 mg/L的贮备液，冷藏备用。标准工作溶液用水把贮备液稀释成40.0mg/L（现用现配）。取10 μL该工作标准溶液至干净的6 mm×50 mm样品衍生管底部，吸取70 μL硼酸盐缓冲液（pH值8.8）至样品管中，涡旋混合，再吸取20 μL AQC衍生试剂到样品管中，立即涡旋混匀10 s，室温放置1 m in；用石蜡膜封口，置55℃干燥箱内加热10 min，取出转移至样品瓶中，10 μL进样，供HPLC分析。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：Waters AccQ·TagTM氨基酸分析柱（3.9 mm× 150 mm，4 μm）；流动相A：AccQ·Tag A浓液与水1∶10（V/V）稀释；流动相B：100%乙腈；流动相C：100%水。流速：1 m L/min；梯度洗脱程序如表1所示；检测波长：248 nm；柱温：37℃；进样量：10 μL。

表1 梯度洗脱程序表Table 1 Gradient elution program table

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

用HPLC法测定黑莓果汁中的GABA含量时，流动相组成及配比影响被分析物的分离效果。实验表明，以AccQ·Tag氨基酸分析方法为基础，采用AccQ·Tag A浓液与水稀释液1∶10（V/V）、乙腈、水溶液为流动相，参照该方法中的梯度，未能使GABA与其他成分有效分离。为了避免杂质对目标峰的干扰，在杂质出峰时间段（19～26 min）对流动相配比进行调整（表1），γ-氨基丁酸的标准工作溶液和典型样品的色谱图见图1。

图1 γ-氨基丁酸的标准工作溶液(a)和黑莓原汁(b)、黑莓浓缩汁(c)、啤酒样品(d)的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of γ-aminobutyric acid standard solution(a),blackberry juice(b),blackberry concentrated juice(c)and blackberry beer(d)

由图1可知，在上述色谱条件下，标准液和样品液在AccQ·TagTM色谱柱上得到了很好的洗脱和分离，γ-氨基丁酸标准品在柱上的保留时间是22.591m in。从色谱图可以看出，其他杂质对测定没有干扰，该方法能很好的对GABA进行分离。采用以上色谱条件检测黑莓果汁中的GABA含量，目标峰峰形尖锐，分离度好，保留时间合适，方法专属性良好。2.2线性关系和灵敏度

图2 γ-氨基丁酸标准曲线Fig.2 Standard curve of γ-aminobutyric acid

将标准贮备液适当稀释，配制成系列质量浓度梯度的标准溶液，在1.3.4条件下依次测定，以峰面积（y）为纵坐标，γ-氨基丁酸质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归分析，结果见图2。其线性回归方程为y=21 012x+ 155 852，相关系数R2为0.999 4，线性范围为0～1 000 mg/L，并以3倍信噪比，得出方法检出限为0.7 mg/L。结果表明，线性关系良好，灵敏度较高。

2.3 准确度和精密度

选取黑莓原汁、黑莓浓缩汁和黑莓啤酒样品，分别添加不同质量浓度的GABA标准溶液，按本方法进行测定，每个质量浓度做6个平行样品。同时做空白实验，均扣除本底值后计算加标回收率和相对标准偏差，试验结果见表2。由表2可知，GABA在黑莓原汁中的加标回收率为97.7%～106.7%，相对标准偏差为2.7%～9.1%；在黑莓浓缩汁中的加标回收率为87.9%～114.9%，相对标准偏差试验（relative standard deviation，RSD）为5.7%～10.9%，在黑莓啤酒中的加标回收率为90.5%～112.6%，相对标准偏差为5.1%～12.3%。本方法的准确度及精密度能满足黑莓果汁及黑莓啤酒中GABA的分析要求。

2.4 样品的检测与分析

应用本方法对市售黑莓果汁产品及试验中黑莓啤酒样品进行测定（3种黑莓原汁；2种黑莓浓缩汁；5种黑莓啤酒），其γ-氨基丁酸含量检测结果见表3。

表3 黑莓果汁及黑莓啤酒中的γ-氨基丁酸含量Table 3 γ-aminobutyric acid content in blackberry juice and blackberry beer

从表3结果可以看出，黑莓原汁的GABA含量为224.8～247.3 mg/L，黑莓浓缩汁的含量为2 053.6～2 101.3 mg/L，黑莓啤酒中GABA的含量为65.5～73.1 mg/L。

3 结论

建立了一种测定黑莓果汁及黑莓啤酒中GABA高效液相色谱方法，并对该方法进行了精密度和准确度的验证实验，综合黑莓原汁、浓缩汁及黑莓啤酒样品的结果，该法的相对标准偏差为2.7%～12.3%；样品中加标回收率为87.9%～114.9%，可以满足对黑莓啤酒及果汁中GABA的检测要求；本方法灵敏度高，专一性强，检出限为0.7 mg/L。可作为质量监督控制的有效方法，为其稳定生产提供高效的技术保障。

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《中国酿造》杂志社

Determination of γ-aminobutyric acid in blackberry juice and blackberry beer by HPLC

HU Xuelian,WANG Honghua,WANG Lina
(Beijing Key Laboratory of Beer Brew ing Technology,Technical Center of Beijing Yanjing Beer Group Corporation,Beijing 101300,China)

The determination method forγ-aminobutyric acid in blackberry juice and blackberry beer was established by HPLC.Using 6-amino quinolyl-N-hydroxy succinimidyl carbamate(AQC)as pre-column derivatization reagent,and Waters AccQoTagTM amino acid column as analysis column,gradient elution was conducted and the detection wavelength was 248 nm.The results showed that the linear equation was y=21 012x+155 852, γ-aminobutyric acid presented good linear relationship in the range of 1-1 000 mg/L,the correlation coefficient R2=0.999 4.The comprehensive recovery rate results of blueberry juice,concentrated juice and blueberry beer was 87.9%-114.9%,the relative standard deviation was 2.7%-12.3%, and the detection lim it was 0.7 mg/L.This method was simple for γ-aminobutyric acid determination in blackberry juice and blackberry beer,and the results showed good stability.

AQC;pre-column derivatization;HPLC;γ-aminobutyric acid;blackberry juice;blackberry beer

O 652.1

A

0254-5071（2015）03-0150-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.03.036

2015-01-12

燕京啤酒集团公司内部课题

胡雪莲（1985-），女，工程师，本科，研究方向为检验分析。