红茶菌的国内外研究现状

李如意，尹军峰，邹 纯，*

(1.中国农业科学院 茶叶研究所，浙江 杭州 310008； 2.中国农业科学院 研究生院，北京 100081)

红茶菌是一种传统的功能性饮料，它是由酵母联合醋酸菌发酵茶糖水而制成[1]。红茶菌菌液中富含茶多酚、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、醋酸、乳酸、D-葡萄糖二酸-1，4-内酯等活性物质[2-3]，具有抗氧化、抑菌、解毒抗癌等功效。红茶菌是一种历史悠久的茶饮料，它的出现最早可以追溯到我国秦朝时期，之后陆续流传到日本、俄罗斯、德国等地。近几年，红茶菌在北美、澳洲和欧洲等地区迅速发展，星巴克、可口可乐、百事公司等多家饮料巨头相继进军红茶菌领域[4]。北美地区成为红茶菌最大的消费市场，占据全球的39.4%[5]。预计到2025年，红茶菌饮料的国际市场规模将达到35亿～50亿美元[6-8]，其发展前景广阔。

尽管红茶菌在我国饮用历史悠久，但它在国内的生产还停留于家庭式、作坊式的阶段。在这些粗放式生产中红茶菌容易出现杂菌污染、品质不稳定等问题，导致市场上鲜有具备较强竞争力的产品，国内市场占有率也很低。随着现代生物学技术的快速发展，人们对红茶菌的认识和研究也逐步深入，这为红茶菌的产业化提供了理论依据。在此背景下，本文梳理和总结了近年来红茶菌在微生物组成及其共生关系、发酵影响因素与保健功能等方面的研究现状，提出了目前红茶菌研究中主要存在的问题，并对其未来发展进行了展望。

1 红茶菌微生物的研究现状

1.1 红茶菌的微生物组成

醋酸菌和酵母菌是红茶菌中的主要菌种，少数红茶菌还含有乳酸菌。研究者们从红茶菌中分离得到的主要细菌和酵母如表1所示。不同文献报道的红茶菌菌种组成存在一定差异，一般是由多种醋酸菌与酵母菌形成的共生体，少数研究者还在红茶菌中发现了乳酸菌。

1.2 红茶菌中各微生物间的共生关系

醋酸菌、酵母菌、乳酸菌为红茶菌中的共生菌落，它们通过相互间的合作与竞争关系使红茶菌产生大量的活性成分。酵母菌作为“启动子”，在发酵初期(0～3 d)将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并通过进一步糖酵解产生乙醇[38]。当培养液中含有葡萄糖和乙醇后，醋酸菌开始大量繁殖，它能将葡萄糖和乙醇分别转化成葡萄糖酸和乙酸[39]。乙酸的存在会刺激酵母菌产生乙醇，乙醇的生成能刺激醋酸菌产生更多乙酸[40]。乳酸菌是一种益生菌，它能利用酵母菌的部分代谢物如维生素和蛋白质等进行生长繁殖，并产生一定量的乳酸。培养液中含有一定量的乙醇后乳酸菌逐渐衰弱，酵母菌重新繁殖并占绝对优势[41]。

2 红茶菌发酵的影响因素

2.1 原料对红茶菌发酵的影响

红茶菌的发酵原料主要包括茶叶和糖类。研究者主要分析了不同茶叶种类与浓度、糖源种类与浓度对红茶菌品质的影响，也有一些研究者将果蔬汁或中草药等植物提取物应用于红茶菌的培养，形成特殊的风味或功效。

在茶叶种类选择方面，红茶或绿茶通常是红茶菌发酵的底物；后来研究者们开始利用黑茶、乌龙茶发酵红茶菌，并研究比较了红茶、绿茶、黑茶、乌龙茶在红茶菌发酵过程中对其功能性成分含量和菌膜生长的影响。孙协军等[42]研究发现，红茶菌总酸和蛋白质含量在以红茶、绿茶、乌龙茶、黑茶作为发酵原料时相近，多酚含量和糖度在以绿茶或红茶作为发酵原料时相对较高。过慈妹[43]研究发现，以绿茶为原料发酵红茶菌形成菌膜的时间较红茶短，且菌膜量较红茶增加；而菌膜量在以乌龙茶为发酵原料时较少，黑茶作为发酵原料时则无菌膜长出。就抑菌物质而言，红茶菌在不同种类茶汤中发酵对抑菌物质的最终形成影响不大。茶汁浓度也是影响红茶菌发酵的重要因素，浓度过低可能导致产品的茶味不足，浓度过高则可能抑制红茶菌生长。王荣荣等[44]发现，茶汁浓度低于0.9%时，随着茶汁浓度的增加菌膜生成量增加，茶汁浓度大于0.9%后菌膜的生成量下降。这可能是由于茶多酚物质含量的增加在一定程度上会抑制红茶菌中微生物的生长，所以当红茶菌茶汁浓度过大后，菌膜的生成量开始下降[44]。袁磊等[40]研究发现，茶叶添加量越大，产酸率越高。综上所述，茶汁中的氨基酸、维生素、微量元素等营养物质能够促进红茶菌的生长，但其中的茶多酚等物质在浓度较高时会抑制红茶菌的生长，此外，茶汁浓度还影响了红茶菌的风味品质。因此，在红茶菌的制备中需将茶叶添加量控制在合适的范围。在糖源种类与浓度选择方面，研究者主要比较了红糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖等糖源对红茶菌主要成分和pH的影响，并进一步分析了不同糖浓度对红茶菌产酸率和感官品质的影响。孙协军等[42]研究发现，在以红糖、蔗糖、葡萄糖作为糖源发酵的红茶菌中，红糖发酵的红茶菌茶多酚与蛋白质含量最低，pH最高；蔗糖、葡萄糖发酵的红茶菌蛋白质含量、pH没有差异，但蔗糖发酵的红茶菌茶多酚含量高于葡萄糖发酵的红茶菌中茶多酚含量。Reiss[45]在20～22 ℃条件下研究不同浓度不同糖源(蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖)对红茶菌pH和代谢产物的影响，结果表明，果糖和蔗糖能产生较多的乙醇，而葡萄糖则产生少量的乙醇。在糖添加量对红茶菌的影响方面，袁磊等[40]发现，糖添加量较低时红茶菌味淡色浅，糖添加量较高时红茶菌过甜色深，并且较高的糖添加量会形成高渗透压，从而抑制微生物的生长，故不宜添加高浓度的糖。

表1 红茶菌共生体系中的微生物组成

此外，为了赋予红茶菌更好的保健功效，近年来出现了许多将果蔬汁或中草药等植物提取物应用于红茶菌培养的报道。比如往红茶菌中分别添加肉桂[46]、小麦草汁[47]、葡萄汁[48]、各类水果[49]、老山芹汁[50]、枸杞金银花[51]、红枣汁[52]和石榴汁[53]等等，使得制备的红茶菌口感独特，香气各异，且营养成分和抗氧化活性得到改善。

2.2 培养条件对红茶菌发酵的影响

近年来，有关红茶菌培养条件的研究主要集中在研究发酵温度、pH与通气方式对红茶菌品质的影响。

培养温度对红茶菌中菌种的生长、产酸、菌膜生成和红茶菌口味等均有影响。就菌种生长温度而言，26～30 ℃为酵母菌的最适生长温度[34]，醋酸菌在28 ℃时生长最快，但不得超过40 ℃[54]。在产酸与代谢物方面，实验表明，菌种在红茶菌中发酵产酸的最佳温度是30 ℃[54]。分别在22、30 ℃发酵红茶菌，在30 ℃下红茶菌发酵产生的酸、葡萄糖、果糖和维生素C含量更高[55]；这可能是由于30 ℃条件下菌种生长速度加快，代谢物生成量增多。乔宏萍等[56]分别在20、25、30、35 ℃下发酵红茶菌，结果发现，在20 ℃下红茶菌的菌膜产生较少且口味差，随着发酵温度的升高，菌膜生成与口味均有改善。

pH是影响红茶菌发酵的最重要环境参数之一，它会影响红茶菌菌种的生长和抑菌效果。王丽丽等[57]研究表明，低酸条件可促进红茶菌的生长繁殖，但pH过低则不利菌种的生长。醋酸菌可耐受的pH范围是3.6～6.3，酵母菌的最佳pH取决于菌株种类，但平均范围在4.5～6.5[58]。张虎成等[59]研究发现，抑菌圈在pH为7时最小，当pH<7时，抑菌圈随pH的逐渐增大而减小，当pH>7时，抑菌圈随pH的升高又逐渐增大。由于较低pH会导致饮料的总体感官品质下降，故应合理把握红茶菌饮料的pH；有研究表明，当总酸度达到4～5 g·L-1时，获得的酸性饮料令人愉悦[60]。

传统的红茶菌采用的是静止培养的方式，但一些研究者发现，通过振荡通气的方式可加速红茶菌生长、降低菌膜的生成量并提高红茶菌产率。醋酸菌、酵母菌作为红茶菌中的主要菌种，在氧气存在的情况下能更好地将葡萄糖转化成乙酸、乙醇等物质，并为乳酸菌的生长提供丰富的营养基质[61]，故通气方式在红茶菌菌种的生长中发挥着重要的作用。王硕等[62]研究表明，振荡通气培养可以促进菌群生长(酵母菌和木醋酸菌数量分别是静止培养时的3倍和4倍)，抑制菌膜生成，从而减少糖类等碳源物质的损耗。李昊燃[63]研究表明，静态培养的菌膜呈薄膜状且产量高，而振荡培养的菌膜呈丝带状或者絮状且持水性比静态培养好。综上所述，通气方式对红茶菌的生长和产酸、菌膜的产量和性质均具有较大影响。

2.3 菌种组成对红茶菌发酵的影响

传统的红茶菌培养方式是在煮沸过的糖茶水中加入带有菌膜的红茶菌液，并对其进行静置培养。这种方式发酵时间长，易染杂菌，且由于红茶菌中复杂的微生物组成导致红茶菌口味不尽相同，难以满足标准化生产的需要[39]。为早日实现红茶菌工业化规模生产，近年来出现的“从红茶菌和自然界中筛选适合生产红茶菌的纯菌种并进行组合搭配”成为研究的一个新思路。

研究表明，纯菌混合发酵技术对红茶菌发酵具有缩短培养周期、促进功能性成分生成、提高部分保健功效的作用。王鸿志等[64]和林娟等[65]以不同的菌种组合发酵红茶菌，与传统红茶菌相比，红茶菌的发酵时间缩短，且滋味爽口、风味独特。Nguyen等[36]从传统红茶菌中筛选适合生产葡萄糖醛酸的酵母与醋酸菌，并将筛选出的酵母DekkerabruxellensisKN89与醋酸菌Gluconacetobacterintermedius按4：6(2种菌的活细胞数比)混合发酵，结果发现，发酵7 d红茶菌中可生成175.8 mg·L-1的葡萄糖醛酸，这为安全生产富含葡萄糖醛酸的红茶菌提供了参考。Wang等[66]研究表明，用巴氏醋杆菌、木葡糖醋杆菌和拜氏接合酵母混合发酵获得的红茶菌比各菌株单独发酵的菌液具有更高浓度的有机酸。陈雪娇等[67]采用自主筛选的醋酸菌纯种和市售纯菌酵母菌、乳酸菌进行红茶菌饮品改良发酵，以及传统产膜红茶菌发酵，对比有效成分发现，菌种组合搭配生成的红茶菌发酵液产酸能力、抗超氧阴离子自由基能力、游离氨基酸、8种必需氨基酸生成能力和SOD活性较传统的红茶菌液有明显的改善。王国增等[68]将酿酒酵母、葡糖醋杆菌和植物乳杆菌按体积比1∶1∶1菌种配比进行复配，得到的红茶菌具有较强的抗氧化能力。另外，不同菌种之间混合培养时，微生物之间会因为代谢途径和代谢能力的不同而相互促进或抑制[69]。

总之，深入研究培养条件、菌种、原料对红茶菌发酵的影响是实现红茶菌的工业化应用、统一红茶菌工业化生产标准的基础。

3 红茶菌的保健功能研究现状

近年来，国内外对于红茶菌保健功能的研究主要集中在抗氧化、抑菌、护肝、提高免疫力和防癌抗癌等方面。

3.1 抗氧化功能

3.2 抑菌功能

红茶菌液对霉菌等真菌的抑制作用有限，但对革兰氏阴性和阳性细菌具有明显的抑制作用[75]。目前已报道的可被红茶菌抑制的微生物有大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、单增李斯特菌、荧光假单胞菌、致病性大肠埃希菌、产毒性大肠埃希菌、猪霍乱沙氏杆菌、蜡状芽孢杆菌、大肠埃希菌、幽门螺杆菌、根瘤脓杆菌、鸡沙门氏菌、霍乱弧菌等[68，73，79-82]。研究表明，红茶菌的抑菌作用主要来源于茶多酚、共生体系在代谢过程中形成的乙酸、葡萄糖酸二酸等代谢产物和多种微生物共同作用形成的抗菌蛋白等[83]。申瑞瑞等[84]通过热处理试验和低温浓缩试验发现，红茶菌发酵液中可能存在对热敏感的抑菌活性物质，例如多肽类或蛋白类物质。李璐路[83]研究发现，高浓度酸性物质和抑菌蛋白的共同作用使得红茶菌发酵液有抑菌效果，且发酵液总蛋白浓度与抑菌效果呈正相关。王恩智等[85]研究表明，茶多酚对金黄色葡萄球菌和普通变形杆菌(尤其是肠道致病菌)具有不同程度的抑制和杀伤作用，其中对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度为62.5 mg·mL-1。Greenwalt等[86]和Steinkraus等[87]研究表明，乙酸是红茶菌发酵液里具有抑菌作用的重要物质，乙酸等有机酸可降低溶液的pH，进而导致酸度引起的缺氧，这可能是致病菌受到抑制的一个重要原因[88]。

3.3 护肝功能

红茶菌的护肝作用是由于其中的抗氧化成分对肝脏起了抗氧化作用或通过调节氧化应激等实现的，但也有研究认为D-葡萄糖二酸-1，4-内酯是红茶菌护肝作用的关键成分[76]。Lee等[89]研究表明，红茶菌可通过影响脂质代谢来保护肝细胞免受脂质毒性。吴雅茗等[90]研究发现，红茶菌菌液对四氯化碳导致的小鼠急性肝损伤有保肝降酶的作用，该作用可能与提高小鼠肝脏抗氧化损伤能力有关。Wang等[76]研究表明，红茶菌能对乙酰氨基酚诱导的ICR小鼠急性肝损伤起到改善的作用，这可能得益于D-葡萄糖二酸-1，4-内酯。此外，葡萄糖醛酸能与肝脏中的毒素分子结合，并将它们从机体中清除，从而起到护肝的功效[88]。

3.4 提高免疫力功能

红茶菌不仅能促进免疫相关基因的表达，还可以增强免疫细胞活性。王春龙[91]将不同浓度的红茶菌冻干产物灌给免疫力低下的小鼠，通过qRT-PCR方法发现，枸杞金银花红茶菌发酵饮料可促进IL-2、IL-6、IFN-γ、Cox-2、Mcl-l和Bcl-xL等与免疫相关的基因表达上调。Wang等[92]研究表明，高中剂量的红茶菌能够增强腹腔巨噬细胞功能和淋巴细胞增殖活性，是一种有效的免疫调节剂。李波清等[93]研究发现，对小鼠长期进行红茶菌灌胃处理可增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，并明显提高小鼠自然杀伤细胞的杀伤活性。

3.5 防癌抗癌功能

红茶菌中起抗癌作用的主要成分是D-葡萄糖二酸-1，4-内酯，有研究认为它能抑制与癌症发生有关的β-葡聚苷酸酶的活性，从而减少致癌物的生成[94]。另外，部分研究者对红茶菌抗癌机制进行了研究。比如Srihari等[95]研究发现，红茶菌通过降低血管生成刺激物的表达可显著降低前列腺癌细胞的存活率；俸毅等[96]发现，红茶菌菌液能够快速降解亚硝酸盐，并在降解过程中产生大量的NO，从而对预防胃肠癌起到一定的保健作用。此外，红茶菌可以降低胃的pH，这对胃肠道中的有害菌如幽门螺杆菌等有拮抗作用，还可预防结肠癌的发生[97]。

4 问题与展望

近年来，虽然人们对红茶菌在微生物组成、营养成分、发酵制备技术、保健功能等方面进行了广泛研究，但是红茶菌的研究目前还存在以下不足：(1)研究者对红茶菌中小分子的功能性成分(如有机酸、酯类)分析得比较透彻，但对一些活性大分子(如抗菌肽)的种类、形成机制研究较少且不深入；(2)随着高通量测序技术的日益成熟，红茶菌中的微生物组成已基本明确，但这些复杂的微生物中究竟哪些菌起益生作用，起何种益生效果尚不明确；(3)当前红茶菌的研究大部分采用玻璃杯、摇瓶等简单容器进行相对粗放的培养，缺乏应用发酵罐精准控制的研究，对红茶菌的规模化、标准化制备参考价值相对较小；(4)由于茶多酚的氧化络合、微生物的代谢和衰亡等原因，导致红茶菌存在产品稳定性较差的问题，这也是限制其产业化的重要因素。

随着人们对健康品质需求的日益增加，风味独特且具有多种保健功效的红茶菌正在飞速发展，并推动着茶饮料行业的升级。今后红茶菌的发展方向主要包括以下几个方面：(1)系统探明红茶菌发酵中微生物组成的变化规律和目标代谢物的形成机制，通过特定菌种的组合、精准的发酵调控实现红茶菌的标准化制备；(2)丰富红茶菌的产品形式，开发菌种存活率高、产品稳定性好的粉剂或片剂；(3)明确红茶菌的抑菌机制，促进其在天然、安全食品防腐剂或添加剂等方面的开发和应用；(4)红茶菌合成的细菌纤维素是一种高机械强度、持水性强、生物相容性好的高分子纳米材料，加强其合成机制和性能改良的研究，拓展其在化妆品、纺织、医学材料等方面的应用。