直接稀释-HPLC法快速测定鲜橙中的有机酸和VC

葛宝坤，李淑静，娄婷婷，郑文杰

（天津出入境检验检疫局，天津300461）

直接稀释-HPLC法快速测定鲜橙中的有机酸和VC

葛宝坤，李淑静*，娄婷婷，郑文杰

（天津出入境检验检疫局，天津300461）

采用流动相（乙腈-磷酸盐缓冲液，PH=2.3）为稀释液，建立了样品直接稀释、高效液相色谱（HPLC）分离、二极管阵列检测器（PDA）检测，同时快速测定鲜橙中的酒石酸、VC、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸的可靠方法。该方法以保留时间（Rt）定性，外标法定量；7种组分在0.02mg/mL～3.75mg/mL的浓度范围内，标准曲线有良好的线性关系，相关系数大于0.999 5；样品在0.2、0.5、5.0g/kg3个加标水平的平均回收率为92%～104%（n=10），相对标准偏差为1.1%～2.9%；方法的定性检出限（LOD）为0.02 g/kg～0.05 g/kg、定量检出限（LOQ）为0.05 g/kg～0.2 g/kg。

直接稀释法；HPLC；PDA；鲜橙；有机酸；VC

鲜橙营养丰富，富含VC和有机酸。VC又称抗坏血酸，是人体必须的维生素之一，它有利于提高人体免疫力[1]，防止人体衰老，降低胆固醇等作用[2]，因此测定鲜橙中的VC的含量，对评价其营养价值具有重要意义；橙汁的品质不仅取决于鲜橙的出汁率、固形物、含糖量、含酸量等因素，还取决于鲜橙的口感及风味，由于有机酸的种类和含量是决定鲜橙风味、口感和品质的重要因素之一；另外，有机酸还具有抗癌、镇痛等功能[3]，因此有机酸的分析测定对鉴定鲜橙的真伪、产地尤为重要，也为人们更好地选择优质的鲜橙提供依据。因此分析测试鲜橙中的有机酸和VC，对确定其特征酸及其含量，建立鲜橙中有机酸和VC的指纹图谱对鉴别鲜橙的真伪及其来源显得尤为重要。液相色谱法同时测定鲜橙中有机酸和VC的方法未见报道，同时测定沙棘汁和酸枣中的有机酸和VC的文献已有报道[4-6]，上述文献或存在仅靠色谱条件不能将VC与D-苹果酸很好地分离而造成苹果酸的测定结果偏高，或采用较为繁琐的2次进样分别测定有机酸和VC。目前，测定有机酸和VC的方法主要有滴定法[7-8]、分光光度法[9]、离子色谱法[10]、气相法[11-12]、气质法[13-14]、液相法[5，15-18]、液质质法[19]；滴定法仅适用于总酸的常量分析；比色法的精密度差、灵敏度低；气相法和气质法均需衍生和干燥，操作复杂且易破坏有机酸和VC，液质质法需要昂贵的设备。综上，研究并建立了采用直接稀释前处理、HPLC分离、PDA检测器检测、一次进样可同时检测鲜橙中的6种有机酸和VC的方法，该方法简便、快速、灵敏、重现性好，可供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

e2695高效液相色谱仪：Waters公司，配2998型二极管阵列检测器；MILLI-Q纯水仪：MILLIPORE公司；HITACHI CR22G III型高速离心机。

1.2 试剂

乙腈：色谱纯；磷酸：优级纯，含量≥85%，天津化学试剂三厂；磷酸二氢钠：优级纯，天津永大化学试剂开发中心，含量≥99%；流动相：0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液（pH=2.3）：乙腈=99∶1；混合标准储备液的配制：准确称取的酒石酸125mg、VC50mg、乳酸250mg、乙酸250mg、柠檬酸250mg、琥珀酸375mg、苹果酸25mg标准品（均为CHEM SRVICE公司生产，含量均≥99.5%），用流动相溶解、混匀、定容，即为标准储备液，标准使用液是将储备液用流动相稀释至所需要的浓度。

1.3 方法

1.3.1 样液的制备

鲜橙去皮，采用积压方式取出橙汁，混匀，取橙汁1.0 g（精确至0.01 g）于15mL离心管中，用流动相直接稀释定容至10mL，混匀，4℃、10000 r/min离心10min，上清液过0.45μm滤膜进液相色谱仪分析测定。

1.3.2 高效液相色谱条件

色谱柱：迪马公司，Diamonsil C8 250mm×4.6mm，5μm，或相当者；恒流速：0.6mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；波长：214 nm。

1.3.3 分析测定

根据样液中被测组分的含量情况，选定峰面积相近的标准工作液进行校正，Rt结合PDA光谱图定性、峰面积定量，在色谱条件下，标准色谱图、样品色谱图及待测组分的保留时间见图1。

1.3.4 实际样品检测

对来自四川、云南、湖北、重庆、江西、广西、福建七个产地的冰糖橙、锦橙、血橙、伏令夏橙、早金甜橙、伦晚脐橙、耐湿脐橙等18个品种的鲜橙进行了有机酸和VC的含量检测。

2 结果与讨论

2.1 流动相pH对分离效果的影响

研究了流动相的pH分别为1.8、2.0、2.3、2.5和3.0条件下对测定结果的影响，研究表明：当pH为1.8、2.0、2.3时，对分离效果的影响无显著性差异，而当pH为2.5和3.0时，琥珀酸和苹果酸不能实现很好的分离，同时考虑色谱柱的寿命和分离效果，本研究中磷酸盐缓冲液的pH选择2.3。

2.2 吸收波长的选择

对有机酸最大吸收波长210 nm、214 nm和VC的最大吸收波长245 nm进行了对比研究，结果发现，有机酸在吸收波长214 nm和其最大吸收波长210 nm的响应值差别较小，而VC在214 nm吸收波长时的响应值比最大吸收波长245 nm时的响应值减少了3倍。但是，VC的检测灵敏度是鲜橙中主要有机酸柠檬酸的5倍，因此，选取214 nm为本研究的最佳吸收波长。图1为有机酸和VC的色谱图。

图1液相色谱图Fig.1 LC chromatograms of the mixed standard solution（a）and sample（b）

2.3 方法的线性范围和相关系数

用流动相将标准储备液稀释成质量浓度在0.02mg/mL～3.75mg/mL的范围内，按照优化的色谱条件进行线性分析，以目标物峰面积为纵坐标（Y），以目标物质量浓度之比为横坐标（X）绘制工作曲线，结果表明7种有机酸在0.02mg/mL～3.75mg/mL范围内有良好线性关系，其相关系数均大于0.999 5，结果见表1。2.4 方法的回收率与精密度

表1 方法的灵敏度、线性关系及回收率（n=6）Table 1 Sensitivities，linear ships and recoveries of the method（n=6）

取鲜榨橙汁（按1.3.1操作）1 g（精确到0.01 g），按照0.2、0.5、5.0 g/L 3个加标水平进行加标回收试验，结果为7种成分的平均回收率92%～104%（n=10），精密度小于2.0%，本方法的稳定性良好，结果见表1。

2.5 方法的测定限

按上述样品制备方法取系列样品，由高到底依次加入系列混合标液，按照本试验方法和色谱条件分析测定，根据选择合适的噪比S/N=10时的加标浓度计算本方法的定量限（LOQ）值，信噪比S/N=3时的加标浓度计算本方法的定性限（LOD）值，结果见表1。

2.6 方法的适用性

为了确定方法的抗干扰能力及适用性，分别选取鲜橙中常见的柠檬黄、日落黄，按照本方法条件进行添加干扰测试，结果显示7种待测组分的色谱峰分离度和重现性均较好，符合分析方法的要求。

2.7 实际样品测试

按照本研究方法，对来自四川、云南、湖北、重庆等8个产地的29个不同品种的鲜橙进行了有机酸和VC的检测结果见表2。

VC的含量为0.2 g/kg～1.1 g/kg，酒石酸含量为0.2 g/kg～0.8 g/kg，柠檬酸为4.5 g/kg～21.9 g/kg，L-苹果酸为0.4 g/kg～1.4 g/kg，仅有4个样品检出琥珀酸0.2 g/kg～0.3 g/kg采用本研究方法测得的结果与采用国标方法、行标方法测得鲜橙结果比较表明，二者的差别无显著性，因此方法准确可靠，适用性较强。

表2 18种来自不同产地鲜橙中有机酸和VC的含量Table2 Content of organic acid and VCof orange from 18 different districts of China

续表2 18种来自不同产地鲜橙中有机酸和VC的含量Continue table 2 Content of organic acid and VCof orange from 18 different districts of China

3 结果

本研究的检测方法7种待测组分在0.02mg/mL～3.75mg/mL的浓度范围内，有良好的线性关系，相关系数大于0.999 8；样品在0.2、0.5、5.0 g/L 3个加标水平内的回收率范围为92%～104%，6次测定的相对标准偏差为1.1%～2.9%；方法的定性检出限（LOD）为0.02 g/kg～0.05 g/kg、定量检出限（LOD）为0.05 g/kg～0.20 g/kg，符合色谱分析的方法要求。本研究方法具有操作简单、快速、灵敏、不需要SPE净化柱和昂贵的质谱设备等特点，可供参考。

[1]聂怀鑫,王佃亮.维生素C的免疫功能及缓释技术[J].中国医药生物技术,2013,8(5):380

[2]陈颖雅.维生素C对血糖、尿酸、三酰甘和总胆固醇的影响[J].中国医药指南,2012,10(30):524-525

[3]丁小娟,丁珊珊,吕凌,等.高效液相色谱同时测定宣木瓜中五种有机酸和原儿茶酸的含量[J].安徽医药,2013,17(9):1496-1498

[4]孙延芳,梁宗锁,杨开宝,等.高效液相色谱法分析酸枣中的有机酸和维生素C[J].黑龙江农业科技,1998,17(8):80-82

[5]陆敏,张绍岩,张文娜,等.高效液相色谱法测定沙棘汁中7种有机酸[J].食品科学,2012,33(14):235-237

[6]董彩霞,董园园,王健,等.同一流动相测定植物体内12种有机酸和维生素C的高效液相色谱法[J].土壤学报,2005,42(2):331-335

[7] 雷成康,郭玲.山楂中有机酸含量测定方法的改进[J].中药材, 2010,33(5):745-747

[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.北京:化学工业出版社,2005:22,54

[9]黄志先,戴仁泽.荧光分光光度法定量测定葡萄酒中的苹果酸含量[J],食品发酵工业,1985(6):26

[10]米顺利,夏宁,黄丽,等.不同品种橙汁中有机酸和无机阴离子分析[J].食品工业科技,2012,31(12):123-126

[11]高芸,朱晓兰,杨俊,等.毛细管气相色谱法分析猕猴桃中的有机酸[J].食品科学,2007,28(1):273-275

[12]朱晓兰,高芸,苏庆德.毛细管气相色谱法测定番茄中的非挥发性有机酸、高级脂肪酸和低分子糖类[J].食品科学,2004,25(9):152-157

[13]邓从蕊.气质联用分析葡萄酒中的有机酸[J].分析测试技术与仪器,1996,2(2):5-7

[14]贾春晓,毛多斌,赵玛,等.气相色谱-质谱分析山楂果中的有机酸[J].化学研究与应用,2004,16(3):435-439

[15]黄桂颖,白卫东,杨幼慧,等.反相高效液相色谱法测定荔枝肉中10种有机酸[J].现代食品科技,2009,25(5):568-570

[16]高海燕,廖小军,王善广,等.反相HPLC测定发酵饮料中的有机酸条件优化[J].分析化学,2004,12(12):1645-1648

[17]郭燕,梁俊,李敏敏,等.高效液相色谱法测定苹果果实中的有机酸[J].食品科学,2012,30(2):227-230

[18]孔祥红,付兴隆,姚秉华,等.固相萃取-反相高效液相色谱法同时测定浓缩果汁中的11种有机酸[J].食品科技,2010,35(7):291-295

[19]王乃平,袁艳,江海燕,等.液质联用法同时测定广山楂有机酸含量[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(10):77-78

The Method of Rapid Determination Tartaric Acid，VCby Direct Dilution-HPLC in Fresh Orange

GE Bao-kun，LI Shu-jing*，LOU Ting-ting，ZHENG Wen-jie
（Tianjin Entry-Exit Inspecion and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

A method was developed for simultaneous determination of tartaric acid，vitamin C，lactic acid，acetic acid，citric acid，succinic acid，and malic acid in fresh orange.The sample was diluted directly by mobile phase（acetonitrile-NaH2PO4buffer solution，pH=2.3），and then analyzed by high-performance liquid chromatography（HPLC）with diode array detector（PDA）.The method for qualitative analysis was based on retention time.And external standard method was used for calculation.Good linear relationship was achieved in the range of 0.02 mg/mL-3.75 mg/mL for the 7 components with correlation coefficients above 0.999 5.The recoveries of the method ranged from 92%to104%（n=10）with the relative standard deviations（RSDs）among 1.1%-2.9%at3 spiked levels of 0.2，0.5，5.0 g/kg.The limit of detection （LOD）of this method is among 0.02 g/kg-0.05 g/kg for the 7 components，while the limit of quantification （LOQ）was0.05 g/kg-0.2 g/kg for the7 components.This is a simple，rapid，sensitive method for detection of organic acid and VC.

directdilution；HPLC；PDA；fresh orange；organic acid；VC

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.023

2014-10-23

国家质检总局公益性行业科研专项（201310146）

葛宝坤（1968—），男（汉），研究员，本科，研究方向：残留分析与食品添加剂检测技术。

*通信作者：李淑静，高级工程师，博士。