大海马中总甾醇提取工艺优化及成分分离

孙慧慧，刘长军，顾青，傅玲琳，王彦波，*

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310018；2.象山县水产技术推广站，浙江象山315700）

大海马中总甾醇提取工艺优化及成分分离

孙慧慧1，刘长军2，顾青1，傅玲琳1，王彦波1，*

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310018；2.象山县水产技术推广站，浙江象山315700）

根据香草醛-高氯酸显色反应后样品吸光度的差异，用Box-Behnken响应面法优化了海马中甾醇的提取条件。主要确定了提取温度、提取时间及料液比3个因素对甾醇提取效果的影响。并以胆固醇为标准品，测定了海马中总甾醇的含量。结果表明：提取温度为79℃，提取时间为7.7h，料液比为80ml/g时，海马中的总甾醇提取量最高，提取量为5.17mg/g。通过高效液相分析，初步分离海马总甾醇提取物，为海马中甾醇成分的提取和分离提供了初步的依据。

海马；总甾醇；紫外分光光度法；高效液相；响应面

海马（Hippocampusspp.）又被称为龙落子，隶属于海龙目（Syngnathiformes）海龙科（Syngnathidae）海马属（Hippocampus）[1]，是一种小型海产硬骨鱼类[2]。在我国，海马主要分布于东海及南海亚热带及温带海域[3]。中医认为海马具有补肾壮阳，舒筋活络，散结消肿，止咳平喘的功效[4]，现代研究表明海马的激素样作用、提高免疫力等[5-7]功效与其所含的化学成分相关。许东晖等[8]曾指出主要为胆甾醇类，胆甾烯类等甾体化合物，构成了海马类药材补肾壮阳的基础。例如胆甾醇在睾丸内经一系列酶的催化作用可转化为睾酮，是性激素的前体。海马中的其他成分也可能与其性激素样作用相关。张前进[9]曾指出脂肪酸类物质如DHA是前列腺及精子的物质基础，为海马类药物的补肾作用提供一定参考价值。同时海马中含有大量的钠、锰、锌等微量元素，与其抗衰老，补肾等药理效果也是一致的。许益民等[10]认为磷脂具有补肾壮阳、提高免疫力等功效，同时与机体的生殖及激素代谢，与海马的功效吻合。近年来，大海马因体型大，经济价值高等优点，常见于中药材店。本文以大海马为实验材料，旨在考察海马中总甾醇的提取率及后续活性成分的分离纯化，为大海马成分及功效原理的研究提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

实验所用大海马购自宁波大学海马养殖试验基地，个体湿重（5±0.5）g。

无水乙醇、乙醚、氢氧化钾、冰乙酸、香草醛、高氯酸、甲醇（分析纯）、乙腈（分析纯）、异丙醇（分析纯），以上试剂除特殊标注外，均为分析纯，购于杭州双天生物公司。胆固醇标准品购于上海金穗生物科技有限公司。

1.2 实验仪器

SCT-06索氏提取器：杭州汇尔仪器设备有限公司；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；HH-S数显水浴锅：郑州长城科工贸有限公司；UV-2550紫外可见分光光度仪：SHIMADZ；VersaMaxTM酶标仪：Molecular Devices；Agilent1100高效液相色谱仪：AGILENT；AB135-S分析天平：METTLER TOLEDO。

1.3 实验方法

1.3.1 胆甾醇标准曲线的绘制

实验选取动物甾醇对照品胆甾醇为标准，绘制标准曲线。准确称取27.00mg胆甾醇于50mL容量瓶中，加入无水甲醇定容。带样品充分溶解混匀后，分别取0.10、0.30、0.50、0.60、0.80、1.00mL于试管中，80℃水浴挥干溶剂，分别加入0.2mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸，70℃下显色30min，冰浴迅速冷却，加入4.0mL冰醋酸，充分混匀，用酶标仪在545 nm波长下测定其吸光度值。以吸光值为横坐标，胆甾醇含量为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.2 海马甾醇样品的提取制备

准确称取海马样品1.00 g，粉碎后加入一定比例的无水乙醇溶液，用索氏抽提仪提取。回收溶剂后，将提取液移至圆底烧瓶中，减压干燥，除去溶剂。加入20 mLKOH-CH3OH溶液，于60℃水浴皂化3 h后，冷却，加入40mL蒸馏水，混匀，转移至分液漏斗中，用乙醚萃取3次，每次20mL，合并乙醚萃取液，用饱和NaCl溶液洗涤2次，以无水Na2SO4干燥乙醚萃取液，并用旋转蒸发仪蒸干乙醚溶剂。将提取物溶于10mL无水乙醇溶液中，摇匀，取1mL该溶解液于试管中，蒸干溶剂，按香草醛-高氯酸显色法测定该样品吸光度。根据胆甾醇的标准曲线，计算出样品中的总甾醇含量。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 提取温度对海马总甾醇提取量的影响

称取6份海马粉碎物1.00 g，加入90mL无水乙醇，分别于40、50、60、70、80、90℃条件下抽提6 h，回收溶剂后按1.3.2的步骤皂化后，按5%香草醛-高氯酸显色法在545 nm波长下测定其吸光度。有标准曲线法计算不同提取温度下海马总甾醇的提取量。

1.3.3.2 提取时间对海马总甾醇提取量的影响

称取6份海马粉碎物1.00 g，加入90mL无水乙醇，在70℃的提取温度下，分别抽提3、4、5、6、7、8 h后，以相同的方法测定不同提取时间下海马总甾醇的提取量。

1.3.3.3 料液比对海马总甾醇提取量的影响

称取6份海马粉碎物1.00 g，在70℃的提取温度下，分别按料液比1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90，1∶100加入不同量的无水乙醇，索氏抽提7 h后，回收溶剂，皂化出去提取液中的脂肪酸成分，根据其吸光值判断不同料液比对海马总甾醇的提取量的影响。

1.3.4 响应面设计

根据单因素试验结果，选定提取温度，提取时间和料液比的范围，根据Design-Expert.V8.0.6的Boxbehnken中心组合原理，对3个自变量分别选取3个水平编码为-1，0，1，以海马总甾醇提取量为因变量设计实验组合，确定海马总甾醇的最有提取方案。实验因素及水平见表1。

表1 响应面法提取海马总甾醇的因素和水平Table1 Facts and levels in respond surface design

1.3.5 海马甾醇提取物的高效液相分离

采用配备紫外检测器的Agilent1100型液相色谱仪分离其甾醇提取物，具体实验方法为：取适量海马总甾醇提取物，以色谱纯甲醇溶解，过0.22μm有机膜后，装入液相样品瓶中备用。以乙腈，水，异丙醇为洗脱剂，探讨海马甾醇的分离条件。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

取任意未皂化样品组1.0mL溶液及0.5mL胆甾醇标准品溶液分别加入试管中，80℃水浴挥干溶剂，加入0.2mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸，70℃下显色30min，冰浴迅速冷却，加入4.0mL冰醋酸，充分混匀，分别用紫外分光光度计在300 nm～900 nm进行波长扫描，结果显示未皂化样品的最大吸收波长为532 nm，标准品的最大吸收波长为545 nm，二者相差过大，不能确定选用的最大吸收波长[11-12]。所以对样品进行造化处理，其具体实验步骤为：提取液减压干燥后，加入20mLKOH-CH3OH溶液，于60℃水浴皂化3 h后，冷却，加入40mL蒸馏水，混匀，转移至分液漏斗中，用乙醚萃取3次，每次20mL，合并乙醚萃取液，用饱和NaCl溶液洗涤2次，以无水Na2SO4干燥乙醚萃取液，并用旋转蒸发仪蒸干乙醚溶剂。再将提取物溶于10mL无水乙醇溶液中，按同样步骤进行显色和波长扫描。结果显示，皂化样品和标准品均在545 nm处有最大吸光值，所以选定545 nm为甾醇含量测定波长，并且样品液需进行皂化处理。

2.2 标准曲线

按1.3.1所述方法配置和移取胆甾醇标准品溶液，用酶标仪预读各酶标板孔的吸光值，扣除空白，平行加样3次，取吸光度平均值为x轴，胆甾醇提取量为y轴作出胆甾醇标准曲线，如图1所示。

图1 胆甾醇标准曲线Fig.1 Standard curveof cholesterol

标准曲线的线性回归方程为y=4.788 9x-0.017 4（R2=0.998 7）根据该方程可知，样品中胆甾醇提取量（mg/g）=10×（4.788 9A-0.017 4）/m。式中：A为吸光度；m为海马粉碎物的质量，g。

2.3 单因素实验

2.3.1 提取温度

当提取时间为6 h，料液比为90mL/g时，不同温度下海马总甾醇的提取量见图2。

由图2可知，随着温度的增加，海马总甾醇提取量逐渐增大；在60℃～70℃范围内，总甾醇提取量显著升高；当温度高于70℃，总甾醇提取量增长速度减缓。因此，最佳提取温度为70℃。

图2 温度对总甾醇提取量的影响Fig.2 Effect of extracting temperature on the yield of total sterol

2.3.2 提取时间

由温度单因素试验结果选定提取温度为70℃，料液比为90mL/g，3 h～8 h内不同提取时间对海马总甾醇提取量的影响见图3。

图3 时间对总甾醇提取量的影响Fig.3 Effect of extracting time on the yield of total sterol

当提取时间小于5 h时，提取量随提取时间的增长而缓慢增加；在5 h～7 h内，甾醇提取量增长迅速；当提取时间高于7 h时，甾醇提取量增幅较小，趋于稳定。由图3可知，7 h的提取效果较理想。

2.3.3 料液比

根据提取温度和提取时间的单因素试验结果，选定提取温度为70℃，提取时间为7 h，料液比为1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100mL/g时的甾醇提取量结果如图4所示。

图4 料液比对总甾醇提取量的影响Fig.4 Effect of alcohol/seahorse ratio on the yield of total sterol

由图4可见，随着料液比的增加，甾醇提取量增加，且增幅逐渐增大。可能是因为随着料液比的增加，甾醇的溶出总量增加，但总溶出量的增加速度小于提取液体系体积增大速度，使得提取液浓度减小，传质推动力的作用下，甾醇的总溶出量快速增加。但根据低能耗、低消费及环保的实验原则，最优料液比选为80mL/g。

2.4 响应面分析

2.4.1 响应面实验设计

根据单因素试验结果，选定提取温度、提取时间和料液比3个因素，确定其不同的取值范围，根据Box-benhnken中心组合实验设计原理，以海马总甾醇提取量为响应值，其设计方案及结果见表2。

表2 Box-beknhen试验设计及结果Table2 Design and results of Box-beknhen experiment

2.4.2 模型及显著性检验

根据响应面分析结果，得到海马总甾醇提取量的回归方程：海马总甾醇提取量（mg/g）=4.85+0.38A+ 0.74B+0.62C+0.32AB+0.17AC+0.40BC-0.78A2-0.63B2-0.10C2（R2=0.972 2），其中A为提取温度/℃，B为提取时间/h，C为料液比/（mL/g）。根据表3可知，该模型为极显著（Pr＞F值为0.000 1小于0.01），失拟项为不显著（Pr＞F值为0.096 3大于0.05），所以该模型对实验结果拟合性较好，即该模型可用于预测实验结果。另外本模型的变异系数（C.V.%值）为5.86，表明模型的置信度较高，表明该模型的预测值的准确性，在所取实验条件范围内，可反映出甾醇提取量的变化[13]。由表3也可看出，甾醇提取量与A、B、C、A2、B2呈极显著的相关性，与AB，BC项呈显著相关。根据F值大小，可得出各因素对甾醇提取量的影响大小关系为：提取时间一次项＞料液比一次项＞提取温度二次项＞提取时间二次项＞提取温度一次项＞提取时间与料液比交互项＞提取温度与时间交互项。

表3 试验结果方差分析Table3 Variance analysis table of the test results

2.4.3 响应面及等高线分析

各因素间的交互作用效果可通过响应面以及等高线图观察。响应面的坡度反映了海马甾醇提取量对因素变化的灵敏程度。等高线形状表明两因素的交互作用明显程度，等高线为椭圆形，两因素交互作用明显；等高线图越接近圆形，则两因素的交互作用越不明显[14]。海马甾醇提取的3个因素交互作用的响应面图见图5～图7。图5为料液比为80mL/g时，提取温度和提取时间交互作用效果。响应面坡度较陡，其交互作用对海马甾醇提取量有一定的影响。根据等高线的分布，可知海马甾醇提取量受提取时间的影响较大。提取时间为7 h，料液比和提取温度的交互作用效果见图6。其响应面较平缓，两因素的交互作用对甾醇提取量的影响不明显，料液比对甾醇提取量的影响略大于提取温度。图7则表明提取温度恒定时，提取时间和料液比的交互作用对还马总甾醇提取量有影响，且料液比的影响作用明显高于提取时间。

图5 提取温度和提取时间对海马总甾醇提取量影响的响应面图Fig.5 Response surface plots of extracting temperature and extracting time on the yield of total sterol in seahorse

图6 提取温度和料液比对海马总甾醇提取量影响的响应面图Fig.6 Response surface plots of extracting temperature and liquid-to-solid ratio on the yield of total sterol in seahorse

2.5 高效液相分离结果与分析

对所提取海马总甾醇采用高效液相色谱法进行分离。通过样品全波长扫描，确定其最大吸收波长为205 nm，与甾醇类物质的最大吸收波长相同，表明样品中主要成分为甾醇。其最终分离条件为：

图7 提取时间和料液比对海马总甾醇提取量影响的响应面图Fig.7 Response surface plots of extracting time and liquid-to-solid ratio on the yield of total sterol in seahorse

色谱柱：C18，4.6×250mm，5μm（Thermo Hypersil BDS，USA）；

流动相：由23%乙腈，70%水和7%异丙醇组成的混和液，用于平衡、洗脱；

上样量：10μL；流速：1mL/min；柱温：30℃；

检测器：紫外可变波长检测器；检测波长：205 nm。

海马甾醇的分离图谱见图8所示。由图可知，提取物所含物质种类较多，为5～8种；但其中某种甾醇类成分峰形高且尖，含量相对较高，易于与其他成分分离。

3 结论

1）本文综合了海马总甾醇的提取的3个主要影响因素，根据单因素实验探讨其与海马甾醇提取量的关系，最终通过响应面分析，得到数据模型，确定了最有提取方法为：提取温度：79℃，提取时间：7.7 h，料液比：80mL/g，甾醇提取量：5.17mg/g。

2）通过高效液相色谱分析，确定其甾醇物质的分离条件。扣除溶剂峰后，提取物中含有5-8中含量较高的成分，为后续甾醇成分确定及其功效研究提供一定依据。

图8 海马总甾醇提取物的高效液相分离图Fig.8 The HPLC figure of total sterol in seahorse

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Optimization of Extracting Conditions and Component Analysis of Total Sterol in the Hippocampus kuda

SUN Hui-hui1，LIU Chang-jun2，GU Qing1，FU Ling-lin1，WANG Yan-bo1，*
（1.School of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310018，Zhejiang，China；2.Xiangshan Aquaculture Technology Extending Stations，Xiangshan 315700，Zhejiang，China）

In the present work，we optimized the extracting conditions of total sterol in Hippocampus kuda by Box-Behnken response surface method according to the difference in absorbance of vanillin perchloric acid color reaction.Three factors associated with extraction effect were determined，including extraction temperature，extraction time and ratio of material to liquid.The content of total sterol in the hippocampus was also determined with a standard of cholesterol.The results showed that the highest total sterol extraction amount was obtained to 5.17mg/g when the extraction temperature was at79℃，extraction time at 7.7 h，and the ratio of solid to liquid at 80 mL/g.The purified sample was further identified by high performance liquid chromatography（HPLC）.This paper provided a preliminary basis for the extraction and separation of the sterol composition in Hippocampus kuda.

Hippocampus kuda；total steroid；UV spectrophotometry；high performance liquid chromatography（HPLC）；response surface method

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.012

2014-09-22

国家海洋经济创新发展区域示范战略性新兴产业发展专项项目和宁波市科技计划重大专项（宁波市农业科技攻关项目）（2014C10006）

孙慧慧（1989—），女（汉），硕士生，研究方向：水产品活性物质及作用。

*通信作者：王彦波，教授，博士。