基于内滤效应荧光检测牛奶中土霉素含量*

毛永强，梁密，李宁，李娜

(辽宁工程技术大学理学院，辽宁阜新，123000)

土霉素(oxytetracycline，OTC)是一种广谱抗生素，在农畜牧业上曾作为预防、治疗畜禽疾病的动物药物和促进畜禽生长的饲料添加剂而广泛使用。但过量使用，在动物性食品中的土霉素残留易通过食物链危害人体健康，因此许多国家已经对食品中土霉素最大残留限量做出规定［1-2］。现有土霉素残留的检测方法主要有紫外分光光度法［3］、荧光光度法［4］、液相色谱法［5］、液相色谱-质谱联用法［6］、化学发光法［7］、毛细管电泳法［8］、电化学传感器［9］等，但上述方法仪器设备昂贵、操作复杂耗时，因此建立一种简便、快速、灵敏的土霉素含量检测方法对于保障人民身体健康具有重要意义。

量子点(quantum dots，QDs)是一种荧光纳米材料，因其激发光谱宽、发射光谱窄、颜色可调、光稳定性好等优点引起研究者的广泛关注，并以其作为荧光探针已用于致病菌［10］、生物毒素［11］、农兽药残留［12-13］、非法添加剂［14］和重金属［15］等食品分析检测领域。内滤效应(Inner-filter effect，IFE)是在非共价偶联荧光传感体系中，因荧光体的激发光谱与吸收体的吸收光谱有相当程度的重叠，而导致荧光体的荧光发射强度显著降低。内滤光效应将吸光体的光吸收信号转变为更为灵敏的荧光信号，从而提高检测方法的灵敏度，已经用于三聚氰胺、氰化物的定量检测［16-17］。

本文通过水热合成巯基乙酸修饰的CdTe量子点，发现土霉素的吸收光谱和CdTe量子点的荧光激发光谱有很大程度的重叠，基于土霉素和CdTe量子点之间的内滤效应，即土霉素吸收CdTe量子点发射的激发光能量，引起CdTe量子点的荧光强度显著降低，且CdTe量子点的荧光猝灭强度与土霉素浓度在一定范围内呈良好的线性关系，建立一种测定土霉素含量的荧光分析法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

F-4500型荧光分光光度计，日立公司;UV-3010型紫外-可见分光光度计，日立公司;AUX320型电子分析天平，岛津公司;pHS-3C型pH计，上海精密科学仪器有限公司;DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，山东鄄城华鲁电热仪器有限公司。

碲粉，硼氢化钠(NaBH4)，巯基乙酸，氯化镉(CdCl2·2.5H2O)，所用试剂均为分析纯;土霉素，美国飞世尔科学世界公司;实验用水为二次蒸馏水。

袋装鲜牛奶样品，购于当地超市。

1.2 实验方法

1.2.1 CdTe量子点的合成

采用水热法合成巯基乙酸修饰的 CdTe量子点［18］。准确称取43 mg碲粉和80 mg NaBH4，加入5 mL蒸馏水溶解，在氮气保护下，4℃冰浴中磁力搅拌反应8 h，即生成NaHTe前驱体溶液。在250 mL三口烧瓶中加入0.142 7 g CdCl2，100 mL蒸馏水溶解后，逐滴加入107 μL巯基乙酸溶液，用1.0 mol/L的NaOH溶液调节溶液pH值为11.0，通氮气10 min后，磁力搅拌下注入新制备NaHTe溶液;继续通氮气，100℃油浴反应2 h，得到实验所需的水溶性CdTe量子点。合成的CdTe量子点溶液中加入无水乙醇，离心后收集沉淀，用去离子水将其重新溶解，4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 荧光测定

在5 mL比色管中，加入0.2 mL的CdTe量子点溶液、0.5 mL的Tris-HCl缓冲溶液(pH值6.5)和一定体积的土霉素标准液或提取液，蒸馏水定容到刻度并摇匀。室温下放置5 min后，在激发波长330 nm条件下(激发和发射狭缝宽度均为5 nm)，分别测定加入土霉素溶液前后体系在激发波长520 nm处的荧光强度F0和F，计算体系的荧光猝灭值ΔF=F0-F。

2 结果与讨论

2.1 土霉素与CdTe量子点之间的反应机理

采用荧光光谱法和紫外可见吸收光谱法，考察CdTe量子点的激发光谱和土霉素的紫外-可见吸收光谱(如图1所示)。由图1可以看出，在200～400 nm内，CdTe量子点的激发光谱宽而连续，最大激发峰位于300 nm;而土霉素在275 nm和360 nm处强烈的吸收峰，且与CdTe量子点的激发光谱有较好地重叠，从而满足二者发生荧光内滤效应的条件。

图1 CdTe量子点的荧光激发光谱(a)和土霉素的紫外-可见吸收光谱(b)Fig.1 Fluorescence excition spectrum of CdTe QDs(a)and absorption spectrum of OTC(b)

2.2 不同浓度土霉素对CdTe量子点荧光光谱的影响

在激发波长330 nm条件下，分别扫描加入土霉素溶液前后CdTe量子点的荧光光谱，进一步考察不同浓度土霉素对CdTe量子点荧光光谱的影响(如图2所示)。由图2可以看出，未加入土霉素时，CdTe量子点在520 nm处有最大荧光发射峰;随着土霉素浓度的增加，CdTe量子点荧光强度逐渐降低，表明土霉素和CdTe量子点之间发生有效的内滤效应，即土霉素吸收CdTe量子点发射的激发光能量，而导致CdTe量子点的荧光强度显著降低。因此可以利用土霉素调控CdTe量子点的荧光强度，从而建立一种荧光测定土霉素含量的新方法。

图2 不同浓度土霉素存在下CdTe量子点的荧光光谱Fig.2 Fluorescence emission spectrum of CdTe

2.3 实验条件优化

2.3.1 pH值的影响

在不同pH值Tris-HCl缓冲溶液条件下，分别测定加入土霉素溶液前后CdTe量子点的荧光强度，考察Tris-HCl缓冲溶液pH值对体系荧光猝灭强度的影响(如图3所示)。由图3可以看出，在强酸性或强碱性的Tris-HCl缓冲溶液中，土霉素对CdTe量子点的荧光强度具有一般性猝灭，而当pH值为6.5时，体系荧光猝灭值ΔF达到最大。因此试验选择Tris-HCl缓冲溶液pH值为6.5。

图3 pH值对体系荧光猝灭强度的影响Fig.3 Effect of pH value on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in presence of OTC

2.3.2 CdTe量子点浓度的影响

在5 mL比色管中，分别加入一定量的土霉素溶液和不同浓度的CdTe量子点溶液，作用一段时间后分别测定加入土霉素溶液前后CdTe量子点的荧光强度，考察CdTe量子点浓度对体系荧光猝灭强度的影响(如图4所示)。由图4可以看出，随着CdTe量子点浓度的增加，体系荧光猝灭值ΔF逐渐增大，当CdTe量子点浓度为5.0×10-6mol/L时ΔF达到最大值，但继续增加CdTe量子点浓度，ΔF反而逐渐降低。选择CdTe量子点浓度为5.0×10-6mol/L。

图4 CdTe量子点浓度对体系荧光猝灭强度的影响Fig.4 Effect of CdTe concentration on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in presence of OTC

2.3.3 反应时间的影响

在5 mL比色管中，分别加土霉素溶液和CdTe量子点溶液，作用一段时间后分别测定加入土霉素溶液前后CdTe量子点的荧光强度，考察反应时间对体系荧光猝灭强度的影响(如图5所示)。由图5可以看出，土霉素溶液加入CdTe量子点溶液5 min后，体系荧光猝灭值ΔF达到最大，且在随后25 min内基本保持稳定。因此选择反应时间为5 min。

图5 反应时间对荧光猝灭强度的影响Fig.5 Effect of time on fluorescence quenching intensity of CdTe QDs in presence of OTC

2.4 标准曲线的绘制

在最佳实验条件下，在5 mL比色管中加入一定量的CdTe量子点溶液和Tris-HCl缓冲溶液，同时加入不同浓度的土霉素溶液，反应5 min后测定体系的荧光强度，以体系荧光猝灭值(ΔF)对土霉素浓度(c)作图(如图6所示)。由图6可以看出，随着土霉素浓度的增加，体系荧光猝灭值ΔF逐渐增大，且与土霉素浓度在2.0～20.0 μg/mL内呈良好的线性关系，线性方程为ΔF=6.082 73c-0.5，相关系数r为0.999 5，检出限为0.05 μg/mL(按3SD/斜率计算，其中SD为11份空白溶液的标准偏差)。同时对10.0 μg/mL的土霉素溶液进行11次平行测定，其相对标准偏差为2.3%。

图6 标准曲线Fig.6 Standard curve

2.5 干扰性实验

当土霉素浓度为10.0 μg/mL时，考察牛奶中常见物质对土霉素含量测定的影响。结果发现，当相对误差在 ±5.0% 内，500 倍的K+、Na+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Cl-、NO3-、SO42-、PO43-和100倍的乳糖、蔗糖，对土霉素含量测定基本无影响，表明该方法具有较好的选择性，可用于牛奶中土霉素含量的测定。

2.6 样品中土霉素含量测定及回收率实验

准确量取1.0 mL牛奶样品置于50 mL离心管中，加入10 mL乙酸盐缓冲液-乙腈混合溶液(体积比1∶4)，振荡摇匀5 min，5 000 r/min 离心 20 min 除去蛋白质。取上清液至分液漏斗中，加入5 mL正己烷，振荡摇匀5 min，静置分层后弃去正己烷层。吸取下层清液，用正已烷反复脱脂至澄清，溶液经0.22 μm滤膜过滤后得待测液。

准确吸取一定体积的样品待测液，按照实验方法测定其荧光强度，未检出土霉素。为考察方法的可行性，同时进行加标回收实验。由表1可以看出，加标回收率在97.4% ～103.5%，相对标准偏差均小于2.4%，表明该方法具有较好的准确度和精密度。

表1 土霉素在牛奶样品中的回收率(n=6)Table 1 Recoveries of OTC in milk samples(n=6)

3 结论

从水热合成巯基乙酸修饰的CdTe量子点中发现，土霉素吸收光谱和CdTe量子点的荧光激发光谱有较好地重叠，基于土霉素和CdTe量子点间的内滤效应，建立一种测定土霉素含量的荧光分析法。在优化实验条件下，CdTe量子点的荧光猝灭值与土霉素浓度在一定浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数r为0.999 5，检出限为0.05 μg/mL。该方法操作简便、稳定性好，能够用于牛奶中土霉素含量的测定。

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