中性蛋白酶生产菌种AS1.398的多相复核鉴定*

张欣，刘勇，李金霞，程池

(中国食品发酵工业研究院中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京，100015)

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)AS1.398是中性蛋白酶的生产菌种，俗称1.398或1398，在我国蛋白酶制剂工业上有多年的使用历史［1］。该菌株产生的蛋白酶可在中性条件下催化蛋白质肽键水解，分解为多肽及游离氨基酸，广泛应用于食品、饲料、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业［2］。

目前对1.398中性蛋白酶生产菌种的研究主要集中在诱变育种、酶学特性、发酵特性、蛋白酶基因克隆表达等方面，未见对该菌种的种属鉴定报道。近几年来，我国对生产菌种的管理越来越严格，如2010年卫生部发布的《可用于食品的菌种名单》中对可用于食品的微生物菌种种类进行了规定，2013年农业部发布的《饲料添加剂目录》中对可用于饲料的酶制剂生产菌种及可直接添加的微生物种类进行规定。基于1.398中性蛋白酶及其生产菌种在食品、饲料等领域的广泛应用和重要地位，本文利用16S rRNA、gyrA、gyrB多基因位点分析结合生理生化表型特征对1.398中性蛋白酶生产菌种CICC 10888进行多相复核鉴定，从而对其科学种属分类地位进行论述。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

中性蛋白酶生产菌种1.398(=CICC 10888)，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。

1.1.2 培养基与试剂

营养琼脂(NA)培养基、营养肉汤培养基胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基，北京陆桥技术有限责任公司;Taq DNA 聚合酶、dNTP、DL 2000 Marker，天根生化科技有限公司;GoldView，北京塞百盛基因技术有限公司;溶菌酶，Sigma公司;蛋白酶 K，Merk公司;API 50 CHB和API 20E试剂条，法国梅里埃公司;其他化学药品均为进口分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 形态学观察

将供试菌株接种于NA培养基，置于37℃培养24 h后，观察其菌落形态，革兰氏染色观察菌体形态特征;将供试菌株接种于TSA培养基，置于37℃培养24 h后，芽胞染色观察芽胞形态［3］。

1.2.2 16S rRNA基因序列分析

利用细菌基因组DNA提取试剂盒(Tiangen公司)提取菌株CICC 10888基因组DNA，具体步骤参见试剂盒说明书。以基因组DNA为模板，利用通用引物对16S rRNA基因进行扩增［4］。测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。测序结果用Chromas软件参照正反序列图谱人工校对。将测序得到的结果在EzTaxon server 2.1数据库中进行比对［5］，确定与已知近缘种序列的相似性。采用CLUSTAL W对1.398菌种及其若干近缘种16S rRNA基因序列进行多序列比对［6］，并利用N-J法通过MEGA 4软件进行系统发育树分析［7］。

1.2.3 gyrA、gyrB基因序列分析

以菌株CICC 10888的基因组DNA为模板，对靶基因gyrA(DNA促旋酶A亚基基因)和gyrB(DNA促旋酶B亚基基因)进行扩增，反应条件参照［8-9］。纯化后的PCR产物由北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。测序得到的结果在GenBank数据库中进行比对分析，并通过MEGA 4软件进行系统发育树分析［7］。

1.2.4 API检测及生理生化特征

采用API 20 E、API 50 CH、API ZYM试剂条对菌株CICC 10888的酶活性、碳源利用、发酵产酸等生理生化表型特征进行检测，具体操作方法按试剂条说明书进行。

将菌株接种于营养肉汤培养基，分别置于15、25、35、45、50 和 55 ℃温度下培养 48 h，观察菌株对温度的耐受性。

将菌株接种于添加10%NaCl的营养肉汤培养基，37℃培养48 h，观察菌株对10%NaCl的耐受性。

2 结果与分析

2.1 形态学观察

CICC 10888在营养琼脂(NA)培养基平板上菌落呈乳白色，微凸起，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明(见图1);利用光学显微镜观察显示菌体细胞杆状，成对或成链排列，大小为(0.3～0.7)μm×(1.5～3.0)μm，革兰氏阳性(见图2)。TSA培养基培养24 h，芽胞呈柱状，端生，胞囊不膨大(见图3)。

图1 CICC 101888在营养琼脂(NA)培养基上的菌落形态Fig.1 The colonical morphology image of CICC 10888 on NA

图2 菌株CICC 101888在营养琼脂(NA)培养基培养24 h的显微形态Fig.2 The cell morphology image of CICC 10888 on NA for 24h

图3 菌株CICC 101888在TSA培养基培养24 h的芽胞形态Fig.3 The spore morphology image of CICC 10888 on TSA for 24 h

2.2 16S rRNA基因序列分析

测序得到的菌株CICC 10888的16S rRNA基因序列信息提交至 GenBank，获得登录号KM654296。以Bacillus cereus ATCC 14579(AE016877)为外群，构建CICC 10888与相关近缘模式菌株的系统发育树(见图4)。

图4 CICC 10888 16S rRNA基因系统发育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of CICC 10888 16S rRNA gene

由系统发育分析可断，CICC 10888归属为枯草芽胞杆菌群(Bacillus subtilis group)，与解淀粉芽胞杆菌解淀粉亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.amyloliquefaciens)、解淀粉芽胞杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)、西姆芽胞杆菌(B.siamensis)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)等聚为一个系统发育分支，16S rRNA基因序列相似性均高于99%。

2.3 gyrA、gyrB基因序列分析

gyrA、gyrB基因可作为芽胞杆菌属内种间分子生物学鉴定的重要判据，能够有效区分枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌以及其他枯草芽胞杆菌群近缘种［10-14］。以菌株 CICC 10888的基因组 DNA为模版，利用特异性引物(BS-gyrA-f/BC-gyrA-r［12］;BC-gyrB-f/BC-gyrB-r［13］)对 gyrA 和 gyrB 基因进行扩增，序列信息提交至 GenBank，获得登录号分别为KM667968和KM654297。

gyrB基因序列分析显示(见图5)，菌株CICC 10888与解淀粉芽胞杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)的gyrB基因序列相似度为99%，而与其他近缘种的相似度均低于97%，与枯草芽胞杆菌(B.subtilis)相似性仅为74%。gyrA基因序列分析显示(见图6)，菌株CICC 10888与解淀粉芽胞杆菌植物亚种(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)的gyrA基因序列相似度最高(98%)，与其他近缘种的相似度均低于97%，与枯草芽胞杆菌(B.subtilis)相似性仅为69%。通过gyrA和gyrB基因发育分析，菌株CICC 10888被鉴定为解淀粉芽胞杆菌植物亚种(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)，与原名称枯草芽胞杆菌(B.subtilis)不符。

图5 CICC 10888 gyrB基因系统发育分树Fig.5 Phylogenetic analysis of CICC 10888 gyrB gene

图6 CICC 10888 gyrA基因系统发育树Fig.6 Phylogenetic analysis of CICC 10888 gyrA gene

经16S rRNA、gyrA和gyrB基因序列的分子发育分析，菌株CICC 10888被鉴定为解淀粉芽胞杆菌植物亚种(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)。

2.4 生理生化特征鉴定

API试验及辅助生化试验结果显示，菌株CICC 10888能水解明胶;具有β-葡萄糖苷酶、细胞色素氧化酶活性;并能够利用蔗糖、糖原、D-乳糖等多种碳源物质，生长温度15～50℃，能耐受10%NaCl(表1)。生理生化特征与文献报道［15］的解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)一致。

表1 CICC 10888生理生化特征检测结果Table 1 The physiological and biochemical characteristics of CICC 10888

2.5 鉴定结论

综合形态学观察、16S rRNA基因序列系统发育分析、持家基因(gyrA和gyrB基因)的比对分析及生理生化特征试验结果，1.398中性蛋白酶生产菌种CICC 10888被鉴定为解淀粉芽胞杆菌植物亚种(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)。

3 讨论

多相分类(polyphasic taxonomy)的概念最早是由Colwell［16］提出的，是综合微生物多种不同信息，包括表型、基因型和系统发育分析，对微生物进行分类的方法，已广泛应用于微生物分类学研究领域，能够更加科学准确地确定微生物的种属分类地位。本文采用多相分类鉴定技术对中性蛋白酶生产菌种CICC 10888进行种水平分类地位的复核鉴定，鉴定发现CICC 10888为解淀粉芽胞杆菌植物亚种(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)，与原名称枯草芽胞杆菌(B.subtilis)不一致。

解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)最早由Fukomoto于1943年提出［17-18］，由于其形态与枯草芽胞杆菌极为相似，而且仅仅通过生理生化试验很难与后者区分开来，因此并未得到认可，很长时间以枯草芽胞杆菌命名。又因为其具有产生丰富的胞外α-淀粉酶和蛋白酶的特性，后来提出将其作为枯草芽胞杆菌的一个亚种(B.subtilis subsp.amyloliquefaciens)或变种［19］。直至1987年，Priest等人通过DNA同源性证明了解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)是区别于枯草芽胞杆菌群其他种的一个独立种［20］。随着分类学的发展，解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)又细分成两个亚种解淀粉芽胞杆菌解淀粉亚种和解淀粉芽胞杆菌植物亚种［14］。本文通过多相鉴定手段首次对1.398中性蛋白酶生产菌种进行了复核，重新鉴定为解淀粉芽胞杆菌植物亚种。为规范菌种使用，建议将1.398中性蛋白酶生产菌种更名为解淀粉芽胞杆菌植物亚种。

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