生物柴油副产品粗甘油浓度对裂殖壶菌生长与积累油脂的影响*

吴论文，杨美慧，姚瑶，万晓云，周茂洪

(温州大学生命与环境科学学院，浙江温州，325035)

生物柴油(脂肪酸甲酯)因其环保性、可再生性、良好的可燃性吸引了人们的目光［1］。传统的生物柴油原料主是大豆油、菜籽油、棕榈籽油、向日葵籽油等［2］，但是以植物油脂为原料需要占据大量土地，这势必会影响粮食的生产［3］，且用油料植物为原料虽方便但是成本却很高［4］，所以利用微生物生产油脂逐渐引起了人们的兴趣。裂殖壶菌一直以来被认为是理想的DHA生产菌株［5］，其较快的生长速率和较高的油脂含量使其新近又成为生物柴油原料的开发目标之一。

粗甘油是生物柴油生产过程中的副产物，每生产1 L的生物柴油就会产生80 g的粗甘油［6］。精制后的粗甘油可以应用于化妆品、食品和医药等工业领域，但精制成本很高，而且生物柴油生产快速发展所产出的粗甘油远远超过精甘油的市场需求，造成精甘油价格急剧下跌，粗甘油则几乎成了工业垃圾，若不及时处理，有可能会成为一种新污染源。Meesters等早在1996年就已经发现粗甘油可以在生物的转化下生成具有附加价值的产物——油脂［7］。Chi等人也证明以粗甘油为碳源培养Schizochytrium sp.可以得到与以葡萄糖为碳源相似的生长速率和细胞密度［8］。同时以葡萄糖为碳源生产油脂的这种以5 t糖生产1 t油的高成本生产模式，其弊端也日益显现出来［9］。而国内该方面的研究鲜有报道。

作者曾研究了以生物柴油副产品粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的优化的培养条件，本文在此基础上着重研究了粗甘油浓度对裂殖壶菌生长和积累油脂的影响，为进一步的高密度培养研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)WZU6961，从采自浙江省温州市乐清湾西门岛南岙山红树林的腐败落叶上分离获得，保存于-70℃超低温冰箱内。

1.2 粗甘油

取自温州中科新能源科技公司，为以餐厨废油(地沟油)为原料生产的生物柴油副产品。

1.3 培养基

种子培养基(g/L):甘油30、酵母粉10、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 2.0、K2SO40.65、KH2PO41.0、CaCl2·2H2O 0.17、NaCl 15、(NH4)2SO41、MnCl2·4H2O 0.003、ZnSO4·7H2O 0.003、CoCl2·6H2O 0.000 04、Na2MoO4·2H2O 0.000 04、CuSO4·5H2O 0.002、Ni-SO4·6H2O 0.002、FeSO4·7H2O 0.01，硫胺素0.010、核黄素 0.020、维生素 B60.060、钴胺素0.014、硫辛酸0.030、维生素 K 0.020、烟酸0.010、叶酸0.030，pH 6.5～7.0。

发酵基础培养基:同种子培养基。

1.4 生物量的测定

取10 mL发酵液于干燥称重后的离心管中，4 000 r/min下离心10 min，用蒸馏水洗涤2～3次后，于90～100℃下烘干至恒重(约24 h)后称重。

1.5 油脂含量的测定

油脂的提取采用酸热法［10］。精确称取0.030 g冷冻干燥菌体在干燥的离心管中，加入4 mol/L的HCl 2 mL振荡混匀，静置30 min后置沸水浴煮3 min，速冷至室温;再加入4 mL氯仿甲醇混合液［V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1］，充分振荡后于4 000 r/min下离心5 min，取氯仿层;再加入等体积的0.1%NaCl溶液混匀，4 000 r/min下离心5 min，取氯仿层至干燥称重后的试管中，置于40～50℃真空干燥箱中真空干燥10 h后称重。

1.6 甘油含量测定

甘油含量采用高碘酸钾法［11］。取经适当稀释的样品10 mL于具塞锥形瓶中，加入25 mL 5.3 g/L的KMnO4溶液，暗处放置30 min，加入200 g/L的KI与2 mol/L HCl各20 mL、蒸馏水15 mL，立即用Na2S2O3标液滴定，近终点时加1 mL淀粉指示液，并将滴定的数据用空白(蒸馏水)校正。

甘油含量/(mg·mL-1)=［(V1-V2)×2.302×M/0.1］/V3

其中，V1—空白消耗 Na2S2O3标液体积，mL;V2—样品消耗 Na2S2O3标液体积，mL;M—Na2S2O3标液浓度，mol/L;V3为样品体积，mL。

1.7 脂肪酸甲酯化和脂肪酸组成分析

采用三氟化硼乙醚催化法进行脂肪酸甲酯化。在1.5真空干燥得到的油脂中，加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液2 mL和内标物(花生酸)1 mL(约0.006～0.008 g)，65℃水浴酯化10 min，加2 mL三氟化硼乙醚，煮沸3 min，冷却后加入1 mL正庚烷，混匀，煮沸1 min，再加入等体积的饱和NaCl溶液，静置分层后取上层正庚烷相进行气相色谱-质谱测定。

气相色谱条件:采用程序升温法，初始温度180℃，保持2 min，然后按5℃/min升到240℃，保持16 min;进样口温度250℃;FID检测器，检测器温度260℃;进样量:1 μm。

1.8 甲醇和蛋白质含量测定

甲醇含量按国标(GB 338—2011)测定，蛋白质含量按国标(GB 5009.5—2010)测定。

1.9 矿物质含量测定

采用原子吸收光谱法［12］。

2 结果与讨论

2.1 生物柴油副产品粗甘油的预处理和成分分析

将生物柴油副产品粗甘油与水以体积比1∶4混合后，调 pH至6.5～7.0，于8 000 r/min下离心10 min去除脂肪酸盐(皂)，然后通过培养基的高压蒸汽灭菌去除甲醇(进行粗甘油成分分析时直接将去皂后的粗甘油在121℃下加热20 min)。

经检测，预处理后的粗甘油的主要成分见表1。

表1 预处理后粗甘油的主要成分Table 1 The major components of the crude glycerin after the pretreatment

2.2 不同碳源培养裂殖壶菌的比较

分别以纯甘油、经预处理后的生物柴油副产品粗甘油和葡萄糖为碳源培养裂殖壶菌，方法为将保藏菌株(1.5 mL冷冻管融化的菌液)接种于装有50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，在25℃、150～160 r/min下活化72 h，然后按体积分数5%的接种量接种于装有100 mL种子培养基的500 mL锥形瓶中，在25℃、150～160 r/min下培养72 h后测定生物量、菌体油脂含量，结果见图1。

由图1可知，分别以粗甘油、纯甘油和葡萄糖为碳源培养裂殖壶菌，其生物量分别为(22.20±3.72)、(22.59±2.72)和(22.24±1.86)g/L，菌体油脂含量分别为(71.58±5.57)%、(70.83±2.95)%和(73.10±3.15)%，其生物量和菌体油脂含量没有显著的区别。

图1 不同碳源下生物量和菌体油脂含量的比较Fig.1 Comparison of biomass and lipid content in different carbon source

2.3 不同粗甘油浓度培养裂殖壶菌的比较

将保藏菌株(1.5 mL冷冻管融化的菌液)接种于装有50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，在25℃、150～160 r/min下活化72 h，然后按体积分数5%的接种量接种于装有100 mL种子培养基的500 mL锥形瓶中，在25℃、150～160 r/min下培养48 h得种子，将种子按体积分数10%接种量接入装有3 L发酵培养基的5 L发酵罐内，在25℃下培养，通过控制搅拌速度和通气量维持整个发酵过程保持0～30%的氧饱和度，定时取样测定甘油浓度、生物量和菌体油脂含量，直至甘油耗完或不再消耗为止。发酵培养基的粗甘油浓度(折算后的实际甘油量)分别为30、60和120 g/L。图2、图3和图4分别为粗甘油浓度为30、60和120 g/L时的发酵进程曲线。

图2 30 g/L粗甘油浓度下裂殖壶菌发酵进程曲线Fig.2 Fermentation proceeding of Schizochytrium sp.WZU 6961 in 30 g/L crude glycerin

从图2可以看出，当粗甘油浓度为30 g/L时，培养26 h后，生物量和菌体油脂含量趋于平衡，其生物量为(24.38±1.42)g/L，菌体油脂含量为(74.08±2.20)%。从图3中可看出，当粗甘油浓度为60 g/L时，培养36 h后，菌体油脂和生物量趋于平衡，其生物量为(31.32±1.15)g/L，菌体油脂含量为(76.86±1.68)%。从图4中可以看出，当甘油浓度为120 g/L时，培养72 h后菌体油脂和生物量趋于平衡，其生物量为(39.89±2.88)g/L，菌体油脂含量为(74.19±1.14)%。

图3 60 g/L粗甘油浓度下裂殖壶菌发酵进程曲线Fig.3 Fermentation proceeding of Schizochytrium sp.WZU 6961 in 60 g/L crude glycerin

将不同粗甘油浓度下Schizochytrium sp.WZU6961发酵参数进行比较，结果见表2，其中甘油消耗量为3个平行样的平均值。随着粗甘油浓度的增加，菌体油脂含量没有显著的变化，但粗甘油的生物量和油脂得率系数以及生物量生产率和油脂生产率逐渐下降，说明粗甘油浓度过高对细胞的生长有抑制效应。从表中看出，粗甘油浓度分别为30 g/L和60 g/L时，生物量生产率分别为0.94 g/(L·h)和0.87 g/(L·h)，油脂生产率分别为0.69 g/(L·h)和0.64 g/(L·h)，两者比较接近。综合考虑，粗甘油培养Schizochytrium sp.WZU6961产油脂的最适宜浓度为30 g/L。

表2 不同粗甘油浓度下Schizochytrium sp.6961发酵参数的比较Table 2 Comparison of fermentation parameter of Schizochytrium sp.6961 in different crude glycercon centration

CHANG［13］等人研究了裂殖壶菌的生长，将裂殖壶菌的生长分为3个时期即细胞生长期(0～18h)、油脂积累期(18～80 h)、油脂转化期(大于80 h)，在细胞生长期细胞生长较快，生物量和油脂快速增加;油脂积累期，细胞繁殖停止，生物量增长停止，但是油脂还在积累;油脂转化期，脂质减少。而本文研究表明(见图2、图3和图4)，细胞生长与油脂积累几乎是同步的，这与CHANG等人的报道不一致。Shannon［14］等人实验则发现，生物量产量和生产率在甘油浓度15～60 g/L时呈上升趋势，在60 g/L以后，呈下降趋势;Pyle［5］和 Chi［8］等实验得出的菌体平均产率分别在粗甘油浓度为40 g/L和64～85 g/L达到最大。而本文的研究结果也与之不同，随着甘油浓度的提高，生物量产量和生产率逐渐下降，只是粗甘油浓度分别为30 g/L和60 g/L时，生物量生产率和油脂生产率比较接近;这种差异可能是与粗甘油的品质［14］或者培养基的成分或者菌种不同有关。LIANG等的实验证实最适合细胞生长和达到油脂最大值的的粗甘油浓度为35 g/L，并且他们认为随着甘油浓度的增加而生物量的减少可能是由于底物抑制或者是甲醇和皂的负作用［15］，这与本文的结果基本一致。

图4 120 g/L粗甘油浓度下裂殖壶菌发酵进程曲线Fig.4 Fermentation proceeding of Schizochytrium sp.WZU 6961 in 120 g/L crude glycerin

2.4 不同粗甘油浓度下培养的裂殖壶菌油脂脂肪酸组成比较

将在不同粗甘油浓度下培养的裂殖壶菌发酵液，在8 000 r/min下离心10 min后得菌体，用去离子水洗涤2次后，进行冷冻干燥，按1.7方法测定油脂的脂肪酸组成，结果如表3所示，表3中数据为3个平行样的平均值。由表3看出，不同粗甘油浓度下培养的裂殖壶菌油脂的脂肪酸组成没有显著的差异。

表3 不同粗甘油浓度下培养的裂殖壶菌油脂脂肪酸组成比较Table 3 Comparison of fatty acid composition of Schizochytrium sp.6961 in different crude glycer concentration

续表3

3 结论

本文在研究了以生物柴油副产品粗甘油培养裂殖壶菌产油脂的优化的培养条件的基础上，着重研究了粗甘油浓度对裂殖壶菌生长和积累油脂的影响，为进一步的高密度培养研究奠定基础。结果表明，在温度、溶氧和培养基其他组分相同的培养条件下，随着粗甘油浓度的增加，菌体油脂含量和脂肪酸组成没有显著的变化;但甘油的生物量和油脂得率系数以及生物量生产率和油脂生产率逐渐下降，说明甘油浓度过高对细胞的生长有抑制效应;粗甘油浓度分别为30 g/L和60 g/L时，生物量生产率分别为0.94 g/(L·h)和0.87 g/(L·h)，油脂生产率分别为0.69 g/(L·h)和0.64 g/(L·h)，两者比较接近;综合考虑得出适宜的粗甘油浓度为30 g/L。甘油浓度为30 g/L时，发酵时间26 h，生物量、菌体油脂含量和DHA占油脂比例分别为(24.38±1.42)g/L、(74.08±2.20)%和23.72%。

［1］ 夏金兰，万民熙，王润民，等.微藻生物柴油的现状与进展［J］.中国生物工程杂志，2009，9(7):118-126.

［2］ 宋东辉，侯李君，施定基.生物柴油原料资源高油脂微藻的开发利用［J］.生物工程学报，2008，24(3):341-348.

［3］ Lardon L，Heslias A，Sialve B，et al.Life-cycle assessment of biodiesel production from microalgae［J］.Environ Sci Technol，2009，43(17):6 475-6 481.

［4］ ZHANG Y，Dube M A，McLean D D，et al.Biodiesel production from waste cooking oil:1.Process design and technological assessment［J］.Bioresour Technol，2003，89(1):1-16.

［5］ Pyle D J，Garcia R A，WEN Z-Y.Producing docosahexaenoic acid(DHA)-rich algae from biodiesel-derived crude glycerol:effects of impurities on DHA production and algal biomass composition［J］.J Agric Food Chem，2008，56(11):3 933-3 939.

［6］ Thompson J C，He B B.Characterization of crude glycerol from biodiesel production from multiple feedstocks［J］.Appl Eng Agric，2006，22(2):261-265.

［7］ Meesters P，Huijberts G N M，Eggink G.High cell density cultivation of the lipid accumulating yeast Cryptococcus curvatus using glycerol as a carbon source［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1996，45(5):575-579.

［8］ CHI Z-Y，Pyle D，WEN Z-Y，et al.A laboratory study of producing docosahexaenoic acid from biodiesel-waste glycerol by microalgal fermentation［J］.Process Biochemistry，2007，42(11):1 537-1 545.

［9］ Cohen Z，Ratledge C.Single Cell Oils-Microbial and Algal oils(2nd edition)［M］.The Illinois:AOCS Press，2010:4.

［10］ 马建设，韩方方，叶海仁，等.裂殖壶菌油脂提取方法的研究［J］.温州大学学报(自然科学版)，2009，30(6):21-24.

［11］ 李素敏，蔡计荣.高碘酸钾法测定去甘油红细胞的甘油残留量［J］.中国输血杂志，1999，12(3):179-179.

［12］ 张宗培.仪器分析实验［M］.郑州:郑州大学出版社，2009:35-44.

［13］ CHANG Gui-fang，LUO Zheng-lin，GU Si-tian，et al.Fatty acid shifts and metabolic activity changes of Schizochytrium sp.S31 cultured on glycerol［J］.Bioresource Technology，2013，142:255-260.

［14］ Shannon Ethier，Kevin Woisard，David Vaughan，et al.Continuous culture of the microalgae Schizochytrium limacinum on biodiesel-derived crude glycerol for producing docosahexaenoic acid［J］.Bioresource Technology，2011，102(1):88-93.

［15］ LIANG Yan-na，Nicolas Sarkany，CUI Yi，et al.Batch stage study of lipid production from crude glycerol derived from yellow grease or animal fats through microalgal fermentation［J］.Bioresource Technology，2010，101(17):6 745-6 750.