富氢水对重复力竭运动大鼠骨骼肌氧化应激损伤的影响*1

李　晨　吕晨曦　庞　力　吴　磊

(1. 泰山医学院，山东 泰安　271000；2. 泰山学院，山东 泰安　271000)

富氢水对重复力竭运动大鼠骨骼肌氧化应激损伤的影响*1

李晨1吕晨曦1庞力1吴磊2

(1. 泰山医学院，山东 泰安271000；2. 泰山学院，山东 泰安271000)

摘要：目的探讨富氢水对重复力竭运动大鼠骨骼肌氧化应激损伤的影响。方法成年雄性SD大鼠100只，随机分为2组：对照组、实验组。重复运动的动物模型构建：大鼠在跑台上进行下坡跑，速度18 m/min，坡度-16度，大强度重复运动(力竭运动)。设立实验组、对照组(实验组运动前30min与运动后即刻口服各10ml体重富氢水；对照组相同时间口服同剂量生理盐水)，进行同样的重复力竭运动，在同一时间点分别对对照组、实验组在大强度重复运动(力竭运动)后取股四头肌，同时对实验组大鼠进行治疗量富氢水喂养，考察富氢水对重复运动下大鼠骨骼肌微损伤氧化应激损伤的影响作用，观察对照组、实验组大强度运动(重复运动)下大鼠骨骼肌超微结构变异进行研究。结果补充富氢水后重复运动训练下大鼠骨骼肌超微结构变异研究表明：利用透射电镜对补充富氢水后大鼠进行相同的重复运动(力竭运动)后，该过程中骨骼肌超微结构变化程度看出大鼠股四头肌的微损伤有显著改善，但是仍表现为肌原纤维排列不规则，肌节不完整，Z线变细，肌丝卷曲等。结论大强度运动下骨骼肌超微结构图谱变异与骨骼肌微损伤或者疲劳存在一定的适应性机制，同时对补充富氢水过程中可带来一定的修复机制，富氢水对重复力竭运动大鼠骨骼肌氧化应激损伤具有保护作用。

关键词：富氢水； 重复运动；骨骼肌；氧化应激损伤；

竞技体育发展到今天，竞争日趋白热化。重复运动训练成为必要手段，由此产生的机体疲劳、组织损伤则如影随形，成为严重影响运动员身体健康、竞技能力与运动寿命的关键因素。因此，如何减轻运动性骨骼肌微损伤的程度，提高运动能力，延长运动寿命成为亟待解决的问题。我们的研究旨在揭示富氢水对重复力竭运动后骨骼肌微损伤的运动性适应及损伤机制，为今后提高运动机体疲劳消除及防护机制打下良好基础并提供科学依据。

1材料与方法

1.1一般资料

动物模型构建及分组：成年雄性SD大鼠100只(购于山东农业大学动物实验中心)。重复运动训练对照组(分为5组，每组10只)：重复运动后即刻(B0)、重复运动后48小时(B48)、重复运动后运动168 h(B168)，共5个观测时点。重复运动训练实验组50只，分组及观测时点同对照组。动物分笼饲养，每笼2只，国家标准噬齿类动物饲料喂养，自由饮食饮水，动物室内温度22±3 ℃，相对湿度为50±5%，光照时间为8∶00～18∶00。所有大鼠实验前均未进行过跑台运动。

1.2实验方案

氢气饱和生理盐水的氢气浓度保持在2%左右。经r射线消毒灭菌，无死腔地装于铝袋中常压4℃保存。实验组运动前30 min与运动后即刻口服各10 ml体重富氢水；对照组相同时间口服同剂量生理盐水。

1.2.1重复离心运动的动物造模大鼠在动物跑台上进行下坡跑，速度18 m/min，坡度16 °，运动时间为30 min后休息5 min，再运动30 min。运动时间共60 min。运动1周后，再按照上次运动方案进行一次重复运1.2动。分别在重复运动训练后即刻、48 h、168 h(3个时点)用颈椎脱臼法处死，在股四头肌上取大、小两块肌肉，小块肌肉迅速切成米粒大小的组织块，取材后放入浓度为3.5%的戊二醛固定液中固定过夜(备电镜观察)。

1.2.2电镜标本及切片制作电镜标本用0.1M pH值为7.2的磷酸缓冲液冲洗5次，每隔20 min冲洗一次。用1%的锇酸(四氧化锇)再固定4 h后，再用0.1M、pH值为7.2的磷酸缓冲液冲洗5次，每20 min一次。用梯度乙醇脱水(30%、55%、70%、85%、95%、100%、100%乙醇)每步时间为30 min，再用环氧丙烷过渡两次，每次2 h。使用Epon812树脂浸透，包埋，聚合。使用LKB超薄切片机进行超波切片，用醋酸铀——柠檬酸铅双染色。制成的电镜切片使用美国GE公司生产的透射电镜进行观察，并拍照。

1.2.3指标观察电镜下观察(1)骨骼肌的粗、细两种肌丝、位于肌节的A带、M线、Z线、H带、I带、A带；(2)、横小管：是肌膜向肌浆内凹陷形成的小管网，横小管可将肌膜的兴奋迅速传到每个肌节。(3)线粒体(mitochondrion)：粒体为线状、长杆状、卵圆形或圆形小体，外被双层界膜。(4)细胞核：主要看核膜厚度、基质电子密度高低、有无核边集现象。同一观察组进行光镜检查对照。

1.2.4观察富氢水对重复力竭运动大鼠运动能力的影响，研究富氢水在重复力竭运动骨骼肌微损伤的运动性适应修复机制及抗疲劳效果，进一步确定运动负荷与最适注射富氢水剂量、时间奠定基础。然后，选用氧化应激损伤的标志物3-NT、MDA与8-OHdG这3个指标分别从蛋白质氧化损伤、脂质过氧化损伤、DNA损伤三方面，观察富氢水对重复力竭运动大鼠骨骼肌氧化应激损伤的影响。

1.3实验对象及实验方案

实验对象依据大白鼠为研究对象，针对重复离心运动下大鼠骨骼肌细胞超微结构变化进行研究，观察重复离心运动后大鼠骨骼肌细胞超微结构的变化，以及观察氧化损伤的具体参数。

1.3.1一次离心运动及重复运动的动物模型构建通过电镜下观察一次离心运动以及重复运动对大鼠骨骼肌(股四头肌、树脊肌)损伤程度研究，进一步确定骨骼肌损伤可靠样本，确定运动损伤肌肉的取样时间点。

1.3.2一次离心运动后大鼠骨骼肌细胞超微结构的变化研究利用下坡跑大鼠模型，运动损伤后骨骼肌进行取样，常温下5%戊二醛保存，备检。

1.3.3重复离心运动后大鼠骨骼肌细胞超微结构的变化研究利用相同模型对一次离心运动后的大鼠进行重复离心运动，研究实验组、对照组模型骨骼肌细胞超微结构的差异(取样同上)。所有标本在GE透射电镜下观察，检查结果分别与同种模型的正常骨骼肌细胞进行比较，观察存在的差异。

1.3.4重复离心运动后大鼠骨骼肌氧化损伤的研究重复离心运动后大鼠在观察细胞内结构的同时，选择同一模型血清测定氧化标记物的变化。

2结果

电镜结果对照组运动前30min与运动后即刻口服各10 ml体重生理盐水(图1)显示未受到任何损伤的骨骼肌超微结构。①重复运动即刻AO组(图1)显示正常肌节、线粒体；②重复运动后48h(图2)：肌细胞机能开始恢复，线粒体虽然仍有受到损伤的迹象，但已可以看出正在开始逐渐恢复。③重复运动后168h(图3)：细胞结构、线粒体数量初步恢复，但不明显。

实验组运动前30min与运动后即刻口服各10ml体重富氢水。①重复运动实验组即刻B0组(图7)：仅出现线粒体数量较少的现象，同时有少部分肌节被拉长，产生变化；②重复运动后48h(图9)：肌节I带变长，线粒体的空泡化现象出现，相比较A组，本组的现象细胞结构恢复明显，部分肌节被拉长；③重复运动后168h(图11、12)：骨骼肌超微结构得到充分修复及得到保护，但是仍表现为肌原纤维排列不规则，肌节不完整，Z线变细，肌丝卷曲等表现。

图1　AO：肌节、线粒体基本正常

图2　AO：肌节、线粒体变化不大(×25000)

图3　A48：线粒体虽然仍有受到损伤的迹象，

图4　A48：同左，线粒体结构逐渐清晰。

图5　A168:结果同前一张(x10000)

图6　A168:线粒体结构逐渐清晰(x25000)

图7

图8

图7~8B0：线粒体变化并不大，仅仅出现线粒体数量较少的现象，同时有少部分肌节被拉长，产生变化。

图9

图10

图9~10B48：肌节I带变长，线粒体的空泡化现象出现，相比较A组，本组的现象类似恢复延迟，部分肌节被拉长。

图11

图12

图11~12B168：大鼠股四头肌的超微结构虽然与训练后即刻组和训练后24 h、48h组相比，有显著改善，但是仍表现为肌原纤维排列不规则，肌节不完整，Z线变细，肌丝卷曲，肌浆网肿胀等。(左 x10000; 右x25000)

研究结果显示重复性力竭离心运动引起骨骼肌超微结构的损伤。损伤变化主要表现为：运动后即刻骨骼肌细胞膜发生局部模糊、溶解，肌纤维间嵴有缺损，核膜皱缩，肌细胞内线粒体空泡变性改变。随着时间的延长，至运动后48h损伤程度最重，出现肌纤维排列紊乱、扭曲，肌细胞膜溶解，Z线紊乱呈锯齿状，且部分消失，线粒体空泡变性改变加重。运动后168h，肌纤维排列基本正常，细胞膜部分皱缩，核膜间隙局部扩张，未见肌纤维水肿，Z线明暗带、M线均可分清。实验组运动前30min与运动后即刻口服各10ml富氢水骨骼肌超微结构修复明显，随着时间推移有显著改善，由此得出富氢水对重复大强度力竭运动大鼠骨骼肌氧化应激损伤的具有保护作用。

3结论

3.1离心运动所致的骨骼肌微损伤具有一定的延迟现象，在1次离心运动后即刻，骨骼肌微损伤在电镜下观察变化轻微，但在运动后48 h超微结构出现显著的损伤性变化，而运动后48 h骨骼肌微损伤超微结构可以逐渐适应性恢复，骨骼肌微损伤超微结构呈现显著的适应性恢复。

3.2富氢水重复运动实验组透射电镜观察大鼠骨骼肌超微结构在口服富氢水后具有对骨骼肌微损伤修复防护作用。

3.2.1电镜下直接观察到运动后骨骼肌微损伤超微结构的变化。

3.2.2重复离心运动可以对骨骼肌肌纤维损伤产生一定的累加作用。

3.3超微结构显示，运动后出现骨骼肌结构的损伤性变化，但是，B组较A组在同一时间点损伤减轻，提示：运动性骨骼肌微损伤未必是一种完全的病理过程，可能是骨骼肌适应运动训练刺激的一个介于生理与病理的中间过程。其机理可能是口服富氢水后经过力竭性运动训练损伤修复后的肌肉增强了抗损伤能力的结果。

3.4重复离心运动确实存在骨骼肌微损伤现象，并且骨骼肌超微结构存在运动性适应以及运动性损伤的叠加效应[1][2]。

3.5值得进一步研究的题目

3.5.1离心运动导致的骨骼肌超微结构变化不一定是一种完全的病理过程，是否是肌节的主动适应过程，有待进一步研究。

3.5.2骨骼肌超微结构变化与基质、肌膜结构的关系，有待进一步论证。

3.5.3肌节恢复、重塑过程是否需要炎症因子参与(有学者报道：运动后血液中与炎症反应有关的蛋白、如急相蛋白和炎症过程指示物含量增加)，需进一步探究。

总之，运动与骨骼肌关系的研究虽然是一个老课题，但是，骨骼肌超微结构如何再塑需要深入研究。特别是能够延缓运动性疲劳、减轻骨骼肌微损伤、提高竞技能力且安全有效、无毒副作用的非兴奋剂物质，对如何有效的运动性肌肉疲劳恢复、延迟性肌肉酸痛的消除方法的深入研究，显得尤为重要。随着方法学上的不断拓展，骨骼肌超微结构、运动性骨骼肌微损伤仍有很大的、很深的研究价值，其研究前景十分广阔。

参考文献:

[1]吕晨曦,葛新发.重复运动训练对骨骼肌损伤的超微结构变化[J].科技信息,2012,6:6-7.

[2]董贵俊,吕晨曦,葛新发,等.一次和重复大强度离心运动前后大鼠骨骼肌超微结构变化[J].中国运动医学杂志,2013,32(2):142-148.

[3]Nikolaidis MG,Jamurtas AZ,Paschalis V,et al.The effect of muscle- damaging exercise on blood and skeletal muscle oxidative stress：magnitude and time-course considerations.Sports Med,2008,38(7):579-606.

[4]Corona BT,Rouviere C,Hamilton SL,et al.FKBP12 deficiency reduces strength deficits after eccentric contraction-induced muscle injury.J Appl Physiol,2008,105(2):527-37.

[5]Carlsson L,Yu JG,Thornell LE.New aspects of obscuring in human striated muscles. Histochem Cell Biol,2008,130(1):91-103.

作者简介：李晨(1964—)，男，山东泰安人，副教授，本科，主要从事体育健康教育。

中图分类号：R287

文献标识码：A

文章编号：1004-7115(2015)04-0371-05

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2015.04.004

(收稿日期2015-1-19)

Hydrogen-rich water on oxidative stress injury in rat skeletal muscle after exhaustive exercise was repeated

LIChen1LVChen-xi1PANGli1WULei2

(1. Taishan Medical College, Taian 271000, China; 2. Taishan University, Taian 271000,China)

Abstract:Objective: To investigate the hydrogen-rich water on skeletal muscle oxidative stress in rats after exhaustive exercise was repeated injury. Methods: 100 adult male SD rats were randomly divided into 2 groups: control group, the experimental group. Construction of an animal model of repetitive motion: bench rats ran downhill running, speed 18 m / min, the slope of -16 degrees, repeated high-intensity exercise (exhaustive exercise). The establishment of the experimental group (each 10ml oral immediate weight hydrogen-rich water before and after the experimental group sports and exercise 30min; the same time the control group was treated with the same dose of saline) group, and the same was repeated exhaustive exercise, respectively, at the same time control group, the experimental group were quadriceps strength after repetitive motion (exhaustive exercise), while the experimental group were treated rats fed the amount of hydrogen-rich water to investigate hydrogen-rich water damage in rat skeletal muscle micro-oxidation under repetitive motion the influence of stress injury observed in the control group, the experimental group of high-intensity exercise (repetitive motion) in rat skeletal muscle ultrastructure variation research. Variability of the results of rat skeletal muscle ultrastructure complementary hydrogen-rich water after repeated studies have shown that exercise training: the use of transmission electron microscopy after complementary hydrogen-rich water rats subjected to the same repetitive motion (exhaustive exercise), the skeletal muscle in the process over the extent of structural changes in the micro-micro quadriceps injury in rats seen a significant improvement, but still showed myofibrils irregular, incomplete sarcomere, Z thinning, muscle wire curling. Patterns of variation in skeletal muscle ultrastructure and skeletal muscle damage or fatigue micro-adaptive mechanisms exist certain conclusions high intensity exercise, while the complementary process of hydrogen-rich water can bring certain repair mechanisms, hydrogen-rich water sports on repeat Exhaustive oxidative stress in rat skeletal muscle injury in rats.

Key words:hydrogen-rich water; repetitive motion; skeletal muscle; oxidative stress