MAL蛋白在乳腺癌中表达的研究

常　军

(泰山医学院附属医院肿瘤科，山东 泰安　271000)

MAL蛋白在乳腺癌中表达的研究

常军

(泰山医学院附属医院肿瘤科，山东 泰安271000)

摘要：目的研究MAL在乳腺癌组织中的表达，探讨其与乳腺癌发病的关系，为临床的早期诊断和预后判断提供参考。方法应用免疫组化法检测MAL蛋白、ER(雌激素受体)、PR(孕激素受体)及C-erbB2在乳腺癌组织中的表达情况，分析MAL蛋白和ER、PR、C-erbB2之间的相关性。结果MAL在乳腺癌组织中阳性表达率为26.67%(16/60);对照组织中阳性表达率为78.33%(47/60)，二者比较有显著统计学差异(P<0.05)。乳腺癌组织中ER与MAL阳性率比较具有统计学差异性(P<0.05)， PR与MAL阳性率比较具有统计学差异性(P<0.05)， C-erbB2与MAL阳性率比较具有统计学差异性(P<0.05)。 结论MAL在乳腺癌组织中的表达水平明显降低，表明MAL与肿瘤发生有关。MAL在乳腺癌组织中的表达与CerbB-2呈负相关。

关键词：MAL蛋白；乳腺癌；ER、PR、C-erbB2

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌的流行资料显示，全世界每年约411 000位的女性死于乳腺癌[1]。雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)测定，C-erbB2(human epidermal growth factor receptor-2)蛋白的检测已普遍应用，其阳性表达与癌细胞的耐药和预后有关，C-erbB2阳性患者的曲妥珠单抗治疗已经广泛应用于临床，ER、PR状况更是选择是否进行内分泌治疗的重要指标。但是乳腺癌的发生、发展尤其与多种癌基因的突变及异常表达有密切关系，单一基因常难以确定乳腺癌临床生物学行为。MAL基因于1987年由Alonso[2]等人首先发现，MAL基因 的cDNA克隆呈现在成熟的T淋巴细胞上，属于肿瘤抑癌基因的一类，MAL基因的缺失和肿瘤的发病、复发和转移具有一定的相关性。该课题研究MAL基因在乳腺癌组织中的表达，探讨其与乳腺癌的关系。

1材料与方法

1.1病历资料和试剂

本研究中的乳腺癌组织标本取自泰山医学院附属医院2010年1月至2014年12月的乳腺癌病例，总共60例，对照组乳腺组织标本取自同期病理诊断乳腺增生病例。患者均为女性最小年龄为24岁，最大年龄为74岁，平均年龄为50岁。收集乳腺癌组织及癌旁正常组织蜡块。鼠抗人MAL单克隆抗体、DAB显色试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；鼠抗c-erbB-2单克隆抗体、鼠抗ER(IDS，K-0241)及PR(IA6，K-0448)单克隆抗体均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2方法

1.2.1制备石蜡切片将蜡块制成约4 μm厚的病理切片，切片先行HE染色，光镜下进行形态学观察，核对组织及病理诊断，然后在低倍镜下于癌组织丰富区域用油性笔标出目标区域。

1.2.2免疫组织化学染色采用SP法，SP(streptavidin-perosidase)法，即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。免疫组化染色步骤如下：石蜡切片常规脱蜡；加入过氧化物酶阻断溶液，室温下孵育；热修复抗原；滴加正常山羊血清，封闭非特异性抗原；滴加适当稀释的一抗，湿盒中孵育，阴性对照用PBS液替代一抗；滴加二抗，室温下湿盒内孵育；滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶工作液；DAB显色，光学显微镜下观察，镜下控制反应时间，一般在5~30 min之间，以细胞膜或细胞浆出现棕黄色着色为显色，达最佳效果后，蒸馏水冲洗，终止反应；苏木素复染；封片。

1.2.3结果判断ER、PR以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达，依据阳性细胞所占的百分比将结果分为[3]：(-)所选镜下区域中阳性细胞数<10%或者胞浆着色均为非特异染色；(+)所选镜下区域中阳性细胞数10～25%；(2+)所选镜下区域中阳性细胞数26%～50%；(3+)所选镜下区域中阳性细胞数>50%。

C-erbB2参照FDA推荐的HercepTest评分标准[4]：(-)所选镜下区域中阳性细胞数为少于10%的癌细胞胞膜染色；(+)所选镜下区域中阳性细胞数10～25%癌细胞胞膜呈棕黄色染色，染色间断分布；(2+)所选镜下区域中阳性细胞数26%～50%癌细胞胞膜呈棕黄色染色，包膜染色连续，环绕整个包膜；(3+)所选镜下区域中阳性细胞数26%～50%癌细胞胞膜呈棕黄色染色，包膜染色连续，环绕整个包膜。

MAL主要定位于细胞膜，每例随机选取lO个高倍视野，每个视野计数100个细胞，(不足10个高倍视野计数全部细胞)以此计算阳性细胞数，根据阳性染色细胞数判断结果：阴性(-)：无阳性细胞或阳性细胞数少于、等于5%;弱阳性(1+)：阳性细胞数大于5%且少于、等于25%;中等强度阳性(2+)：阳性细胞数大于25%且小于、等于50%;强阳性(3+)：阳性细胞数大于50%

1.2.4统计学分析应用SPSS13.0统计软件进行分析，计数资料差异性使用χ2检验，等级资料的相关性分析用秩和相关检验。相关性应用Spearman相关性检验，以P=0.05为检验水准。

2结果

2.1MAL在乳腺癌组织和癌旁组织中的阳性表达情况(见表1)。

表1　MAL在癌组织及对照组织中的表达情况

χ2=32.1136,P=0.0000

MAL在癌组织及癌旁组织中的表达情况χ2=32.1136,P=0.0000，MAL在癌组织表达明显降低，表明其可能与肿瘤抑制有关。

2.2MAL与ER、PR及C-erbB-2在乳腺癌组织中的表达相关性(见表2)。

表2　MAL与ER、PR及C-erbB-2在乳腺癌组织中的表达相关性

从表2可以看出，MAL与ER在乳腺癌组织中的表达等级相关系数rs =0.8000,P>0.20，表明两者无明显相关性；MAL与PR在乳腺癌组织中的表达等级相关系数rs =0.2000,P>0.20； MAL与C-erbB-2在乳腺癌组织中的表达等级相关系数rs=-0.6000,P<0.05，表明两者有明显负相关性。

3讨论

乳腺癌的发生、发展以及转移是多因素和多基因的参与，是多步骤突变的结果，对ER、PR和C-erbB-2的研究已经比较成熟，但检测单一的基因异常很难确定乳腺癌的临床生物学行为。在细胞癌变的过程中，既有原癌基因的激活，亦涉及到抑癌基因的失活，两者是一对矛盾的统一体，相互制约，达成一种平衡，控制着细胞的生长与分化。MAL基因属于抑癌基因的一类，该基因于1987年由Alonso[2]等人首先发现。MAL基因的功能包括细胞内运输、基因表达和免疫调节等多方面。MAL基因能抑制肿瘤细胞的侵袭性、活性以及致肿瘤性。MAL基因功能之一可能是高尔基体和远端质膜之间囊泡转运和蛋白质分选的一个功能成分[5]；作为抑癌基因，MAL基因在多数癌组织中下调的机制尚不明确，可能与其启动子区甲基化有关[6]。

Mimori等[7,8]研究发现MAL基因在食管癌组织和癌前病变组织均出现表达缺失， Wang等[9]对MAL基因的检测和分析，表明MAL基因在所有正常食管上皮组织均有表达， MAL基因只在8例肿瘤细胞中有表达， 两者MAL基因的表达具有显著差异性，我们的研究结果表明60例乳腺癌组织中MAL表达阴性者44例；正常乳腺组织仅有13例MAL表达阴性 ，两者比较差异有显著性，表明其表达缺失与肿瘤发生有关。Buffart 等[10]对202例胃癌和22例正常胃黏膜组织中的MAL基因启动子M1区以及M2区甲基化状态进行研究，显示MAL基因发生甲基化率在正常胃黏膜组织和胃癌组织中具有显著差异性。Horne等人[11]发现MAL基因的启动子在早期乳腺癌病人中普遍发生了甲基化，在没有接受辅助化疗的患者中MAL基因在乳腺癌组织中的表达下降，确定MAL基因在乳腺癌中是一种调控基因。

该研究发现乳腺癌组织MAL蛋白表达水平与ER、ER无相关性，但是C-erbB-2的阳性表达和MAL的阳性表达具有负相关性。C-erbB-2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，能够促使细胞进行分裂，促进癌细胞生长，促进肿瘤的侵袭与转移。乳腺癌的组织中的C-erbB-2阳性表达多见于分化差和浸润性的类型，阳性表达率约为20%-40%[12]。众多研究已经证实，C-erbB-2在乳腺癌组织中的表达为阳性的患者通常对常规化疗不敏感，预后较差。MAL基因作为抑癌基因在乳腺癌组织中的低表达，可能两者具有相互的抑制作用，具体机制尚不清楚，有待于进一步的研究。

参考文献：

[1]Banerjee， S. Breast cancer cells secreted platelet-derived growth factor-induced motility of vascular smooth muscle cells is mediated through neuropilin-1[J]. Mol Carcinog， 2006,45(11): 871-80.

[2]Alonso MA， Weissman SM. cDNA cloning and sequence of MAL， a hydrophobic protein associasted with human T-cell differentiation[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1987， 84(7): 1997-2001.

[3]Wittliff， J.L. Molecular signatures of estrogen receptor-associated genes in breast cancer predict clinical outcome[J]. Adv Exp Med Biol， 2008,617:349-357.

[4]Ellis， I.O. Recommendations for HER2 testing in the UK[J]. J Clin Pathol， 2000,53(12):890-892.

[5]Viigand， K， K. Tammus， T. Alamae. Clustering of MAL genes in Hansenula polymorpha: cloning of the maltose permease gene and expression from the divergent intergenic region between the maltose permease and maltase genes[J]. FEMS Yeast Res， 2005,5(11):1019-1028.

[6]Fang， J. Regulation of tissue factor expression by anti-oncogene PTEN in human neuroblastoma cell line[J]. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi， 2007,28(6):363-366.

[7]Mimori， K. Loss of MAL expression in precancerous lesions of the esophagus[J]. Ann Surg Oncol， 2007， 14(5): 1670-1677.

[8]Mimori， K. MAL gene expression in esophageal cancer suppresses motility， invasion and tumorigenicity and enhances apoptosis through the Fas pathway[J]. Oncogene， 2003，22(22): 3463-3471.

[9]Wang， Z. Studies of MAL gene in human esophageal cancer by RNA in situ hybridization[J]. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi， 2000， 17(5): 329-331.

[10]Buffart， T.E. Gastric cancers in young and elderly patients show different genomic profiles[J]. J Pathol， 2007，211(1): 45-51.

[11]Horne， H.N. Inactivation of the MAL gene in breast cancer is a common event that predicts benefit from adjuvant chemotherapy[J]. Mol Cancer Res， 2009,7(2): 199-209.

[12]Hayes， D.F. Circulating HER-2/erbB-2/c-neu (HER-2) extracellular domain as a prognostic factor in patients with metastatic breast cancer: Cancer and Leukemia Group B Study 8662[J]. Clin Cancer Res， 2001,7(9): 2703-2711.

作者简介：常军(1964—)，男，山东泰安人，主治医师，本科，主要从事临床肿瘤内科工作。

中图分类号：R730

文献标识码：A

文章编号：1004-7115(2015)04-0368-03

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2015.04.003

(收稿日期2015-1-13)

The investigation for the expression of MAL in breast cancer Abstract

CHANGJun

(The Affiliated Hospital of Taishan Medical college, Taian 271000，China)

Abstract:Objective: To observe the expression of MAL in breast cancer and to investigate the relationship between MAL and breast cancer， whether it be as an early diagnostic marker for early clinical diagnosis and prognosis. Methods： MAL，ER (estrogen receptor)， PR (progesterone receptor)， C-erbB2 (cancer genes) expression is detected by SP immunohistochemical assay in breast cancer. The correlation analysis of MAL ,ER, PR and C-erbB is used by correlation analysis. Results： The positive rate of the expression of MAL in breast cancer was 26.67%(16/60),but it was 78.33%(47/60)in control group. There was significant difference between two groups. There was significant difference between positive rate of MAL and ER,PR or C-erbB2 in breast cancer. Conclusion： The expression of MAL in breast cancer tissues was significantly decreased， indicating that the tumor inhibitory activity of MAL gene function. There was negative correlation of expression in breast cancer of between MAL and CerbB-2 gene.

Key words:MAL；Breast cancer；ER；PR； C-erbB-2