动物源粪肠球菌快速鉴定方法的建立

欧都·吾吐那生，齐亚银，卜三平，龚子桓，周霞

（1石河子大学动物科技学院，石河子 832003；2巴音郭楞职业技术学院，库尔勒 841000）

肠球菌是人和动物消化道内的正常菌群。但随着肠球菌多重耐药菌株的出现使得肠球菌感染率不断上升，可引起心内膜炎、伤口感染、胆囊炎、肾盂肾炎、膀胱炎、脑膜炎等疾病[1]。在国内外，近年来在人医临床治疗和医院中越来越受到重视，但目前在兽医中该菌尚未引起重视[2]。自1984年独立新菌属以来，肠球菌种已增至41种[3]。各个种之间的形态学特征、生理生化特性、培养特性差异不明显，由于肠球菌的这些特点使得种的水平鉴定显得尤为重要，而菌株的特异性在流行病学监测方面则具有重要的价值[4]。

目前，以肠球菌基因组DNA为基础已建立了多种分子生物学方法，如16S rRNA序列分析在阐明菌属间、菌种之间亲缘关系以及新菌种发现等方面发挥了巨大作用，利用种特异性基因探针[11]建立的PCR技术可快速准确地对23种肠球菌做出准确鉴定等，但由于这些方法操作烦琐、技术要求及成本较高，不适于临床实验室常规应用，只能用于肠球菌的科学研究。然而，目前在兽医临床中对动物粪肠球菌感染还无相应的快速准确鉴定方法。

因此，本研究采集不同动物源的粪样，首先采用链球菌选择培养基进行初步筛选，然后采用tuf基因的PCR方法鉴定到肠球菌属，最后结合分离株的生理生化特性和培养特性，准确鉴定到种，以期建立一种快速准确的鉴定粪肠球菌的方法和程序。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 粪样来源

本试验的样品来源于不同动物的新鲜粪样，肛门式无菌采集。其中羊源：96份；牛源：30份；猪源：36份；鸡源:6份；马源：26份。

1.1.2 主要仪器

光明电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器厂；TC-512 PCR仪，北京德力莱科技发展有限公司；显微镜，日本OLYMPUS公司；超净工作台Boxun，上海博迅实业有限公司；DYY-6B型稳压稳流电泳仪，杭州雷琪实验器材有限公司；Sartorius电子天平，上海欢奥科技有限公司；Sigma离心机（1-15型）、德国SiGMA离心机公司；光明隔水式恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器厂。

1.1.3 主要试剂

PCR相关试剂及试剂盒购自天根生化科技有限公司和TaKaRa宝生物工程有限公司；肠球菌菌属生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司；脑心浸液肉汤购自青岛高科园海博生物技术有限公司；LB琼脂培养基、链球菌选择琼脂培养基均自配。

1.1.4 引物

参照文献[9]中已公布的tuf基因保守区域设计通用引物，上游引物为：5'-TACTGACAAACCATTCAT GATG-3'，下游引物为：5'-AACTTCGTCACCAACGCGA AC-3'，预期扩增产物长度为121 bp，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离纯化

无菌操作，将不同动物源粪便的拭子，接种于LB肉汤、BHI肉汤，置37℃摇床增菌培养18-24 h。将培养菌液划线接种于LB琼脂培养基、链球菌选择琼脂培养基培养18-24 h，观察细菌菌落形态，挑取单个菌落进行革兰染色镜检，进行初步筛选。再将纯培养物接于LB斜面，37℃恒温培养24 h待做进一步鉴定。

图1 分离株在链球菌选择琼脂培养基上的菌落形态Fig.1 Colony morphologies of isolation on Streptococcus agar culture medium

1.2.2 分离株tuf基因属的PCR方法检测

细菌基因组DNA的提取采用煮沸法，即取LB肉汤或BHI肉汤培养18 h的分离株1 mL，12 000 r/min离心 3 min，置 100℃水浴加热 10 min，迅速冰浴冷却，反复冻融数分钟，8000 r/min离心5 min，吸取上清液作为DNA模板进行PCR反应。tuf基因PCR反应体系为20μL；扩增条件为95℃预变性5 min；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 30 s，共 30个循环；最后延伸72℃ 10 min。取扩增产物10 μL，在1%琼脂糖凝胶上以溴酚蓝为指示剂于0.5×TBE中65 V电压电泳30 min，凝胶成像系统分析、拍照、检测扩增产物，以PCR产物出现112 bp条带的分离株为肠球菌。

1.2.3 培养特性鉴定

将分离菌的纯培养物接种于 6.5%NaCl，pH 9.5的肉汤中，分别置 10、45℃培养24 h，观察其对温度及高碱的耐受性。

1.2.4 生化特性鉴定

生化试验参照说明书，将分离菌的纯培养物接种于葡萄糖、棉籽糖、山梨糖、胆汁七叶苷、葡萄糖磷酸盐蛋白胨水、氨基酸脱羧酶、马尿酸钠、精氨酸双水解、β-半乳糖苷（ONPG）、精氨酸脱羧酶等生化鉴定管中进行生化试验。

2 结果与分析

2.1 分离株的形态与生长特性

纯培养的分离株在液体培养物中以长链为主，一般为革兰氏阳性，老龄培养中偶见革兰氏阴性；在BHI肉汤中可见絮状沉淀与试管底部；在LB培养基上生长不良；在链球菌选择琼脂培养基培养中的菌落呈圆形、光滑湿润、表面略光滑，无色透明，边缘整齐的针尖大的小菌落（图1）。对单个菌落进行革兰染色镜检可见单个、成对或短链状排列的革兰阳性呈圆形或椭圆形的球菌（图2）。

图2 分离株菌株液体培养物染色形态（100×）Fig.2 Morphologies of the isolates in broth(100×)

2.2 分离株tuf基因属的PCR检测结果

针对肠球菌高度保守的tuf基因设计的特异性引物对分离株进行扩增，均能扩能出长度为112 bp的特异性条带（图3），即符合肠球菌属的分子特性，而在相同条件下扩增链球菌则得不到相同的结果。因此，扩增tuf基因的PCR方法相比其他的鉴定手段更具有准确性高，费时短的优点。

图3 肠球菌分离株tuf基因PCR电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products of tuf in Enterococcus

2.3 分离株的培养特性鉴定结果

分离株菌能耐受10℃的低温和45℃的高温，可在6.5%的NaCl和pH 9.6的的LB肉汤中生长，表明分离株对低温、高温、高盐和高碱具有很强的耐受性（表1）。该特性为肠球菌属细菌与链球菌的最大区别。

表1 代表分离株的生理生化及培养特性结果表Tab.1 The part of biological characteristics of the isolates

2.4 分离株的生理生化特性鉴定结果

分离株的生理生化特性及培养特性均符合粪肠球菌种的特征，结果见表1。结合生理生化、培养特性结果，将不同分离株的鉴定结果与粪肠球菌的符合率超过97%的列为目标菌，即粪肠球菌200株，包括猪源46株，鸡源27株、牛源96株、羊源17株、马源14株。结果（表2）显示，粪肠球菌的分离率为分别为16.14%、71.05%、33.68%、5.96%、4.91%。

表2 分离株的来源及种属关系Tab.2 Sources of isolates and the relationship among the species

3 讨论

近年来，动物感染粪肠球菌的报道越来越多，造成的危害也越来越大，且其耐药性增强，给临床上治疗带来了困难，同时，耐药基因可以通过食物链传递给人类，人和动物密切接触还可导致人的发病死亡[5-6]。由于不同的肠球菌致病性和耐药性不同，这就迫切要求对感染的肠球菌种进行快速、准确的鉴定。

（1）本实验共采集不同动物源包括猪、牛、羊、鸡、马等的粪样共194份，采用常规细菌分离方法，即用链球菌选择琼脂培养基从样品中筛选出肠球菌纯培养物。在液体培养物中以长链为主，一般为革兰氏阳性，老龄培养中偶见革兰氏阴性；在BHI肉汤中可见絮状沉淀与试管底部；在LB培养基上生长不良；在链球菌选择琼脂培养基培养中的菌落呈圆形、光滑湿润、表面略光滑，无色透明，边缘整齐的针尖大的小菌落。对单个菌落进行革兰染色镜检可见单个、成对或短链状排列的革兰阳性呈圆形或椭圆形的球菌。

（2）与表型特征鉴定方法[7-8]相比，用针对肠球菌高度保守的tuf基因PCR方法进行特异性扩增，结果表明有285株细菌均能扩增出112 bp的特异性条带,而在相同条件下扩增链球菌则得不到相同的结果。由此可见，该方法的使用能有效提高肠球菌分离的准确率，鉴定细菌速度快。因此，扩增tuf基因的PCR方法[12]相比其他的鉴定手段更具有准确性高，用时短的优点。

（3）分离株菌能耐受10℃的低温和45℃的高温，可在6.5%的NaCl和pH 9.6的的LB肉汤中生长，表明分离株对低温、高温、高盐和高碱具有很强的耐受性。该特性为肠球菌属细菌与链球菌的最大区别。葡萄糖、山梨糖、和棉籽糖发酵、葡萄糖磷酸盐蛋白胨水、马尿酸钠、精氨酸双水解、β-半乳糖苷（ONPG）、精氨酸脱羧酶等试验的结果，可以将分离株与同群的其他细菌区分而鉴定为粪肠球菌[11]。本研究分离株的生理生化特性及培养特性均符合粪肠球菌种的特征。

粪肠球菌为人兽共患条件致病菌之一，准确快速地鉴定粪样等标本中是否含有该菌,对于临床治疗具有积极的意义[9-10]。本研究建立的可参考方法和程序可在60 h内完成，操作简便，技术要求低，成本低，且特异性较高，是微生物实验室可选择的常规鉴定方法。

[1] 齐亚银,剡根强,王静梅,等.致羔羊脑炎型粪肠球菌的分离及鉴定[J].石河子大学学报:自然科学版,2005,23(2):200-202.QI Yayin,YAN Genqiang,WANG Jingmei,et al.Isolation and identification of Enterococcus faecalis in lambs with Meningitis[J].Journal of Shihezi University:Natural Science,2005,23(2):200-202.

[2] 韩梅红,谷长勤,胡薛英,等.4株鸭源肠球菌的鉴定和致病性[J].中国兽医报,2007,27(6):821-829.HAN Mei-hong,GU Chang-qin,HU Xue-ying,et al.Identification and virulence of four Enterococcus strains isolated from ducks[J].Chinese Journal of Veterinary Science,2007,27(6):821-829.

[3]Lena Frankenberg,Myriam Brugna,Lars Hederstedt.Enterococcus faecalis Heme-Dependent Catalase[J].Journal of Bacteriology,2002,184(22):6351-6356.

[4]Luc A.Devriese,Bruno Pot,Luc Van Damme,et al.Identification of Enterococcus species isolated from foods of animal origin[J].International Journal of Food Microbiology,1995,26:187-197.

[5] 齐亚银,张莉,王静梅,等.动物源肠球菌的耐药表型及Ⅰ类整合子的检测[J].农业生物技术学报,2010,18(2):329-336.QI Yayin,ZHANG Li,WANG Jingmei,et al.Study on distribution of integron I and resistance phenotype in enterococcus isolates from different animals[J].Journal of Agricultural Biotechnology,2010,18(2):329-336.

[6]Angela G,Ehrmann,Dirk Haller faecalis.Identification of fitness d terminants in Enterococcus faecali s by differential proteomics[J].Arch Microbiol,2013,195:121-130.

[7] 张联璧.鉴定肠球菌属的新试验[J].临床检验杂志,2002,20(8):67-69.ZHANG Lian-bi.The new test for identification of Enterococcus[J].Chinese Journal of Clinical Laboratory Science,2002,20(8):67-69.

[8] 齐亚银,剡根强,王静梅,等.致羔羊脑炎链球菌的部分生物学特性[J].中国兽医杂志,2006,42(3)：20-22.QI Ya-yin,YANGen-qiang,WANGJing-mei,et al.Some biological characteristics of lamb encephalitis caused by Streptococcus[J].Chinese Veterinary Journal,2006,42(3)：20-22.

[9] 周霞,王晓兰,剡根强,等.肠球菌研究进展[J].石河子大学学报:自然科学版,2008,26(6):708-712.ZHOU Xia,WANG Xiaolan,YAN Genqiang et al.Study Progress on Enterococcus[J].Journal of Shihezi University:Naural Science,2008,26(6):708-712.

[10]周霞,马勋,柳建新,等.致羔羊脑炎粪肠球菌人工感染羔羊的试验研究[J].石河子大学学报:自然科学版,2008,26(2):212-215.ZHOU Xia,MA Xun,LIU Jian-xin,etc.Infection due to Enterococcus faecalis lambs Encephalitis in lamb[J].Journal of Shihezi University:Natural Science,2008,26(2):212-215.

[11]李金钟.肠球菌分类与鉴定新进展[J].临床检验杂志,2006(3):228-230.LI Jinzhong.New progress in the classification and identification of Enterococci[J].Chinese Journal of Clinical Laboratory Science,2006(3):228-230.

[12]周霞,王晓兰,剡根强,等.致羔羊脑炎粪肠球菌PCR检测方法的建立和应用[J].中国兽医科学,2008,38(7):595-599.ZHOU Xia,WANG Xiao-lan,YAN Gen-qiang,et al.Development and application of a PCR assay for detection of Enterococcus faecalis causing lamb encephalitis[J].Chinese Veterinary Science,2008,38(7):595-599.