亚洲飞蝗抗菌肽的提取及其部分理化特性的研究

宋欢，王贝贝，赵宁，王海霞，孙艳梅，王俊刚，申红

（石河子大学动物科技学院，石河子 832003）

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物体防御外界病原体侵袭时产生的由基因编码、核糖体合成的一类小分子活性多肽，是生物体内先天性防御系统的重要组成成分，具有非特异性的抗细菌、真菌、病毒等作用，且不破坏机体正常细胞的小分子多肽[1]。目前，已从细菌、昆虫、植物和脊椎动物，包括人类中分离获得抗菌肽，其中昆虫是地球上种类最多、数量最大的生物类群，其防御系统独特，当其受到某些物理刺激或微生物感染后，会引起免疫反应，产生一系列抗菌物质。蝗虫属于昆虫，在我国分布较广泛。新疆石河子位于蒙新区的西部，是亚洲飞蝗(Locusta migratoria L.）的聚集地[2]。亚洲飞蝗属直翅目蝗科，群居性昆虫，存在独特的免疫机制，但有关亚洲飞蝗幼虫抗菌肽的抑菌活性以及特性方面的研究报道较少。

因此，本研究以亚洲飞蝗幼虫为材料，在前期研究细菌诱导蝇蛆24 h产生的抗菌肽浓度较高和强抑菌活性的基础上，对其诱导24 h产生的抗菌肽进行提取，并对其部分理化特性进行研究，旨在为其作为新型抗生素替代物提供新的思路和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试虫

亚洲飞蝗由石河子大学农学院昆虫实验室提供。

1.1.2 菌种

大肠杆菌、葡萄球菌由石河子大学动物科技学院传染病实验室提供。

1.1.3 试剂和药品

甲醛、冰乙酸、氨水、2‰巯基乙醇、35μg/mL苯甲基磺酰氟、无水乙醇、85%磷酸、考马斯亮蓝G-250、标准蛋白质溶液 (用结晶牛血清白蛋白与纯化水配制而成，浓度为100μg/mL)、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂粉、盐酸溶液等均为分析纯级。

1.2 方法

1.2.1 亚洲飞蝗抗菌肽诱导

挑选体重相近的亚洲飞蝗幼虫100只，随机分成4组：大肠杆菌诱导组、葡萄球菌诱导组、大肠杆菌和葡萄球菌混合菌诱导组(采用浓度为1×108CFU/mL菌液2μL分别从亚洲飞蝗腹部注射)和对照组（未处理)。将以上试验组处理的亚洲飞蝗幼虫置于温度为25-32℃，相对湿度为65%-70%的条件下正常饲喂，于饲喂24 h后挑取活的虫体，以备测定。

1.2.2 亚洲飞蝗抗菌肽提取

参考朱小奇等[3]的方法，采用乙酸铵缓冲液浸提方法选取不同细菌诱导的亚洲飞蝗幼虫，用蒸馏水反复冲洗，并用75%乙醇消毒，吸干虫体表面液体，称量后置于研钵中，按重量/体积比为 1∶3加入提取液 (0.05 mol/L、pH=5的乙酸铵缓冲液，35 μg/mL的苯甲基磺酰氟（PMSF），2‰巯基乙醇)，充分研磨，匀浆液于4℃，12000 r/min离心30 min取上清液，重复3次，合并上清液，放至100℃的恒温水浴箱中水浴5 min，然后以4800 r/min在4℃离心30 min，去除变性蛋白，用灭菌注射器抽取不含油层的上清液，装于小试管中标记后放于-20℃冰箱中冷冻备用。

1.2.3 亚洲飞蝗抗菌肽提取液浓度测定

考马斯亮蓝法(Bradford法)测定亚洲飞蝗抗菌肽粗提取液的浓度。用分光光度计测定标准蛋白（结晶牛血清白蛋白）OD595值，以标准蛋白浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度值OD595为纵坐标，绘制标准曲线（图1），测定各试验组抗菌肽粗提液OD595值，结合标准曲线求得亚洲飞蝗抗菌肽粗提液浓度。

图1 标准蛋白曲线Fig.1 Standard protein cure

1.2.4 亚洲飞蝗抗菌肽提取液部分理化特性的测定

1.2.4.1 热稳定性

将葡萄球菌诱导24 h的亚洲飞蝗抗菌肽提取液分别于 50、60、70、80、90和 100 ℃水浴中加热10 min，12000 r/min（4℃）离心 15 min，对每个温度组分别收集上清液，使用游标卡尺测定对葡萄球菌的抑菌直径，每个处理设3次重复，未经热处理的样品为对照组，将对照组的抑菌率设定为l00%。

1.2.4.2 反复冻融的稳定性

将葡萄球菌诱导24 h的亚洲飞蝗抗菌肽提取液置于 -20℃冰箱分别反复冻融 l、2、4、6、8和 10次，冻融后的提取液于12000 r/min、4℃离心15 min，分别收集上清液，用游标卡尺法测定其对葡萄球菌的抑菌活性，每个处理设3次重复，以不冻融的样品作为对照组，将对照组的抑菌率定为l00%。

1.2.4.3 不同pH处理对抗菌肽提取液活性的影响

用盐酸和氨水配置 pH分别为 1、3、5、7、9的溶液，将这些溶液分别与经葡萄球菌诱导的亚洲飞蝗的抗菌肽提取液等体积混合，室温放置l h后检测其对葡萄球菌的抑菌活性，以加等量生理盐水的抗菌肽粗提液作对照，每个处理设3次重复。未经pH溶液处理的样品为对照组，将对照组的抑菌率设定为l00%。

1.2.5 数据处理

采用Excel 2003和SPSS 17.0的One Way ANOVA程序进行数据的差异性检验。虫，测定其抗菌肽粗提液浓度，结果显示用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及其混合菌诱导亚洲飞蝗24 h的抗菌肽粗提液浓度间差异不显著，但均高于未经诱导的亚洲飞蝗组的浓度，与洛雪等[6]研究“用针刺蘸大肠杆菌可以诱导亚洲飞蝗抗菌物质的表达，并在诱导24 h时产生的抗菌肽浓度最高”的结果一致。这提示用不同的细菌诱导刺激亚洲飞蝗幼虫均可以使其产生高表达量的抗菌肽，可能是细菌引起亚洲飞蝗幼虫的诱导型表达属于适应性免疫。

（2）随着抗菌肽一系列功能活性的不断发现，一些直接影响抗菌肽功能活性的理化性质也开始受到关注。Garcia-Olmedo等[7]研究表明，抗菌肽的疏水性增加时，其抗菌活性也逐渐升高；但当疏水性达到一定程度时，该肽段将丧失对真核细胞与原核细胞之间的选择性，继而对真核生物也产生毒性。据此，本实验对亚洲飞蝗幼虫抗菌肽粗提液的部分理化特性进行了研究，用不同温度处理葡萄球菌诱导亚洲飞蝗幼虫的抗菌肽提取液对葡萄球菌抑菌活性的测定结果表明，50-70℃处理的亚洲飞蝗抗菌肽的抑菌活性与未经热处理的对照组间差异不显著（P＞0.05），而经80-100℃处理的抗菌肽提取液显著低于对照组（P＜0.05），温度为100℃时的抑菌率仍然为82.65%，这提示亚洲飞蝗抗菌肽可以耐受高温且具有较好的热稳定性。这可能是因为抗菌肽在水溶性环境中无稳定构象，只有在结合上或接近细胞膜时才形成其发挥功能的高级结构[3]。

（3）亚洲飞蝗抗菌肽粗提液反复冻融的试验结果显示，冻融6次以内的抗菌肽与对照组 (未经冻融)差异不显著（P＞0.05），冻融8-10次的抗菌肽抑菌活性低于对照组（P＜0.05），这提示随着冻融次数的增多，亚洲飞蝗抗菌肽粗提液的抑菌活性逐渐减小，但其冻融10次抑菌率仍在77%以上。由此可见，少次数的反复冻融不会对亚洲飞蝗抗菌肽的活性产生显著影响。这提示亚洲飞蝗抗菌肽可能有耐受低温和反复冻融特性。

（4）据报道大多数昆虫抗菌肽显碱性，其等电点大于7[8-9]。本试验对亚洲飞蝗抗菌肽粗提液经不同pH溶液处理，结果显示经pH酸性溶液处理时，亚洲飞蝗抗菌肽对葡萄球菌抑菌活性较好，pH为7时的抑菌率达到了92.97%，但随着pH值的增加，溶液过碱会影响抗菌肽的活性（P＜0.05）。这提示亚洲飞蝗抗菌肽具有一定的抗酸碱性能。

对亚洲飞蝗抗菌物质诱导表达及其部分理化特性的研究结果表明，亚洲飞蝗抗菌肽具有耐高温和耐酸碱等较稳定的生物学特性，抑菌效果好。本研究可为其今后在畜牧生产上的应用提供参考，而对于其结构、功能和抗菌机理还需要更深入的研究。

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