陆地棉GDSL脂肪酶增强拟南芥对黄萎病菌的抗性

袁哈利 ，郝晓云 ，郑学伟 ，李鸿彬 ，2

（1石河子大学生命科学学院，石河子832003；2石河子大学农业生物技术重点实验室，石河子832003）

黄萎病是棉花生产上危害严重的病害之一。黄萎病是土传性维管束病害，其致病菌主要有2种即大丽轮枝菌[1-2]和黑白轮枝菌[3]，棉花黄萎病病萎症状的产生是由于木质部导管被菌丝和繁殖的孢子堵塞和病原菌产生的毒素共同作用的结果。近年来，黄萎病在我国各棉区屡次大面积发生，给棉花产业造成极大损失[4-5]。因此，研究黄萎病致病机制，进一步利用遗传工程手段培育抗病品种具有重要意义和广阔的应用前景。

植物GDSL脂肪酶是一个大的基因家族，在植物生长发育、形态建成、油脂代谢和防御反应等[6-8]生理活动中发挥重要的生物学功能。GDSL脂肪酶基因的表达能够响应生物和非生物胁迫。植物GDSL脂肪酶基因的表达可被病菌、水杨酸、乙烯、茉莉酸等激素以及非生物胁迫因子所诱导，表明他们可能参与植物抗病和应激反应[9-11]。GDSL脂肪酶可以通过信号传导调节或者直接破坏真菌孢子的完整性，限制病原菌在感染地方生长繁殖[9，12]。在抗病研究中，植物细胞内的许多保护酶如过氧化氢酶（Catalase,CAT）、超氧化物岐化酶（Superoxide dismutase,SOD）、过氧化物酶（Peroxidase,POD）、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyas）和多酚氧化物酶（Polyphendoxidas,PPO）与植物的抗病能力有着密切的关系[13-15]。

棉花作为重要的经济作物，GDSL脂肪酶与黄萎病相关的研究少有报道。本研究从棉花中克隆了1个GDSL脂肪酶基因GhGLIP，对其在受到黄萎病胁迫时的表达调控进行了初步分析；利用大丽轮枝菌菌对野生型拟南芥和转基因拟南芥叶片分别处理，对转基因拟南芥植株对黄萎病菌的抗性进行了研究；对棉花GhGLIP抗黄萎病菌的机制进行分析，以期为进一步抗病品种培育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

大丽轮枝菌（黄萎病菌）、哥伦比亚野生型Col-0拟南芥为本实验室保存，经过处理的叶片材料经液氮速冻，于-80℃冰箱保存待用。

1.1.2 试剂

RNA反转录试剂盒购自大连宝生物公司；对硝基苯酚棕榈酸酯购自上海铭睿生物科技有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.1.3 试验仪器

Eppendorf PCR仪、Eppendorf 5424R型离心机：Eppendorf North America；HVE-50型高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；Tannon Epson100型核酸电泳仪：上海天能设备有限公司；ZF-158型凝胶成像分析系统：上海金鹏分析仪器有限公司；ZSD-A1270A恒温培养箱、ZHWY-100B恒温摇床：上海智诚分析仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取

RNA所用的EP管、枪头、枪头盒、试剂瓶等经过DEPC水处理24 h，高压灭菌处理后使用，研钵和钥匙经180℃烘烤6 h后备用，采用Trizol方法提取拟南芥总RNA。

1.2.2 RNA反转录合成cDNA

用反转录试剂以拟南芥RNA为模板反转录成cDNA。以获得的cDNA为模板进行RT-PCR分析。RT-PCR所用引物从GenBank EST数据库获得片段序列信息，Primer 5设计上下游引物，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，序列见表1。

表1 使用的引物序列Tab.1 List of primer sequences

1.2.3 黄萎病菌（大丽轮枝菌）接种处理

参考李泉木等[16]的方法，将培养好的黄萎病菌配成孢子浓度为1×107个/mL的悬浮液。用接种针在4周大转基因拟南芥和野生型拟南芥子叶叶脉周围刺伤叶片，刺15次/cm2，每个叶片接种10μL孢子悬浮液，用对照用水处理。每棵植株处理3片子叶，每一处理设置6棵植株作为重复。在22℃、光周期为16 h光照/8 h黑暗，光照强度约为6000 lx，60%相对湿度的条件下培养。

1.2.4 细胞坏死染色

将接种过黄萎病菌48 h的叶片，置于DAB（1 mg/mL，pH=3.8）中染色 12 h，用比例为无水乙醇：乙酸∶甘油∶水=8∶1∶1∶1的脱色液在37℃脱色24-48 h，将叶片放在干净的载玻片上，将Trypan blue染液均匀滴于叶面上，盖上盖玻片并静置20 min，用光学显微镜观察拍照。

1.2.4 酶活性测定

脂肪酶活性测定：采用马斯亮蓝G-250法测定蛋白含量，用牛血清蛋白制作6个梯度的标准曲线，制标准曲线。

酶活性分析：反应液中PBS pH7.0 50 mol/L，对硝基苯酚月桂酸酯1 mol/L，异丙醇5%，蛋白50 μg，37℃反应15 min，100℃加热2 min，冷却至室温后，在405 nm处测定吸光度值。

脂肪酶活力计算公式：

酶活力 =△A405×V×K×1000/（T×ε×m）(mmol/min·mg protein)。

其中，A：反应液吸光度；V：反应液体积（mL）；K：稀释倍数；T：反应时间（min）；ε=0.016(μmol/L)-1；m：蛋白含量（mg）。

采用紫外吸收法测定CAT活性，采用NBT法测定SOD活性；采用愈创木酚法测定POD活性；PAL活性测定参考Southern等[17]的方法；PPO活性测定参考薛应龙[18]的方法。

利用SPSS进行F检测分析各酶活性之间的差异性，利用Origin进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 黄萎病菌处理转GhGLIP基因拟南芥的表型分析

用大丽轮枝菌处理转GhGLIP基因拟南芥和野生型拟南芥植株叶片。由图1可见：野生型拟南芥处理1 d后，叶片略微有些萎蔫，处理3 d后，叶片萎焉严重，且出现较多坏死斑，转GhGLIP基因植株叶片仅产生少量坏死斑，无萎缩现象（图1A）。用DAB-台盼蓝染色定量分析其细胞死亡情况，统计分析显示，野生型拟南芥叶片细胞出现大面积死亡，死亡面积达59.05%；转基因拟南芥叶片细胞死亡较少，死亡面积仅11.38%（图1B）。结果表明，GhGLIP增强了拟南芥对黄萎病菌的抗性。

图1 转GhGLIP基因拟南芥叶片对黄萎病菌处理的表型分析Fig.1 Phenotype analyses of GhGLIP transgenic Arabidopsis leaves treated by Verticillium dahlia

2.2 转GhGLIP基因拟南芥的脂肪酶活性分析

分析结果见图2。

图2 GDSL脂肪酶响应黄萎病菌处理的表达分析Fig.2 The expression activity analyses of GDSL lipase responding to Verticillium dahlia

由图2可见，转GhGLIP基因拟南芥和野生型拟南芥受到黄萎病菌（大丽轮枝菌）侵染后，脂肪酶活性呈现逐渐增强的趋势，在接菌3 d后达到最高值，而后表达逐渐趋于恒定，暗示GDSL脂肪酶与拟南芥响应抵抗大丽轮枝菌具有密切关系。

2.3 转GhGLIP基因拟南芥的抗氧化系统酶活性分析

由图3可见：利用水或黄萎病菌处理后，CAT的表达变化不显著；但是与野生型拟南芥相比，在水或黄萎病菌处理后，转基因拟南芥中CAT的表达均高于野生型拟南芥。

黄萎病菌处理后，POD和SOD的表达具有相似性，均受到了病菌的诱导表达，并且转基因拟南芥中POD的表达高于野生型拟南芥。

图3 黄萎病菌处理后拟南芥叶片抗氧化酶的表达分析Fig.3 Analyses of the expression activity of Arabidopsis leaves antioxidases under treatment of Verticillium dahliae

2.4 转GhGLIP基因拟南芥中PAL和PPO的表达分析

由图4可见：黄萎病菌处理1 d后，PAL受到了快速的响应和诱导表达，在处理3 d后达到最高值，随后表达趋于稳定；转基因拟南芥中PAL的表达高于野生型。PPO活性在黄萎病菌处理3 d后达到最高值，其响应速度略低于PAL。这说明PAL和PPO在拟南芥响应病菌处理过程中发挥重要作用，PAL的响应更为快速。

图4 黄萎病菌处理后拟南芥叶片PAL和PPO的表达分析Fig.4 The expression activity analyses of Arabidopsis leaves PAL and PPO under treatment of Verticillium dahliae

2.5 GhGLIP诱导病程相关基因和乙烯信号传递相关基因的表达

分别取接种黄萎病菌转GhGLIP基因植株0、1、3、5、7 d后的叶片材料，以水处理为对照，提取总RNA并反转录成cDNA，以Actin基因为参照，检测病程相关防卫基因和乙烯信号转导相关基因的表达。与水处理的各材料相比，黄萎病菌处理转基因植株叶片中病程相关防卫基因PDF1.2和PR1，以及乙烯信号传递相关基因ERF1和EIN3基因的表达获得了显著的诱导，并且在处理1 d时有显著增加，在处理3 d时达到最大值，随后一直保持稳定表达（图5）。结果表明，转GhGLIP基因拟南芥抗黄萎病菌的能力增强，可能与病程相关防卫基因表达的增强，以及乙烯信号的作用有着密切关系。

图5 黄萎病菌处理后防御基因和乙烯信号转导基因的表达分析Fig.5 Expression levels of defense genes and ethylene signal transduction genes under treatment of Verticillium dahliae

3 讨论

（1）植物GDSL脂肪酶能够参与生物和非生物胁迫下的抗逆反应。拟南芥中的一种分泌蛋白GLIP1能够激发植物局部和系统的抗性，重组表达的GLIP1蛋白可以直接破坏真菌孢子的完整性，从而抑制十字花科黑斑病菌、胡萝卜软腐欧文氏菌和丁香假单胞菌等真菌的生长繁殖。辣椒中的GDSL脂肪酶基因CaGLIP1受到胁迫因子的诱导表达，转CaGLIP1基因拟南芥的GDSL脂肪酶活性显著提高，并且对生物和非生物胁迫的抗性增强[9，19]。本研究将从陆地棉中获得1个GDSL脂肪酶基因GhGLIP转化哥伦比亚野生型拟南芥，对获得的转基因拟南芥植接种黄萎病菌处理，转基因拟南芥中GDSL脂肪酶的表达受到了诱导，转基因拟南芥的抗病性显著增强。转基因拟南芥中抗氧化系统酶如CAT、SOD和POD，以及PAL和PPO的均能快速响应黄萎病菌处理并具有较高的诱导表达，表明这些酶表达在病菌响应过程中起着重要作用。

（2）植物GDSL脂肪酶响应胁迫发挥其功能时，有时需要激素的诱导和调控。乙烯是诱导对病原物防卫反应的重要信号转导分子[20-22]。拟南芥GLIP1蛋白可通过乙烯信号的诱导产生系统抗性，增强对多种病原菌和细菌的抗性[20-21，23-24]。拟南芥GLIP2蛋白在SA、JA和ET的信号诱导下表达，抑制欧文氏菌的生长[20]。本研究中，在黄萎病菌处理后，转基因拟南芥中的乙烯信号转导基因在转录水平的表达有显著提高，细胞内的防御基因PDF1.2和PR1的表达也因受到诱导而增加，但是乙烯信号转导基因的表达更为显著，暗示GLIP基因和乙烯之间的关系密切，以及它们在黄萎病菌响应过程中起着重要作用。

植物的抗病响应是一个复杂的过程，涉及到众多的生理过程，本研究为抗病分子机制解析和进一步的基因工程利用奠定了良好的基础。

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