手性含氮饱和杂环醇的化学法与生物酶法合成

应向贤，范雅君，黄美娟，汪 钊

（浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310014）

引言

许多天然或非天然生物活性物质中均含有含氮杂环结构单元，在含氮杂环上引入手性羟基（尤其是3位羟基）对生物活性有重要影响。手性含氮饱和杂环醇具有活泼的官能团“-OH”和“-NH-”，是合成医药、农药、兽药和其他生物活性物质的重要手性切块，例如，(S)-N-Boc-3-哌啶醇可以合成非天然药物卡普瑞林，或者天然生物活性物质异白刺啉淋胺和小果白刺碱[1]；(R)-N-苄基-3-哌啶醇通过一步酯化可合成第二代二氢吡啶类钙拮抗药贝尼地平。手性含氮饱和杂环醇也可作为手性助剂用于其他手性物质的合成，如以(R)-3-哌啶醇作为手性助剂可以合成手性α-羟基醛[2]。

化学法是工业上合成手性含氮饱和杂环醇的常用方法，包括动力学拆分和不对称还原。为了克服化学催化中的难点，人们一直在不断探索新的生产方法。生物催化具有环境友好、反应条件温和、立体选择性高等优点，尤为研究者所重视。本文以哌啶醇、奎宁醇及吡咯烷醇的手性合成为例，阐述了化学催化和生物催化在合成手性含氮饱和杂环醇上的研究进展。

1 手性哌啶醇

3-哌啶醇是许多药物分子的生物活性结构，如新型广谱抗球虫药常山酮、抗癌新药依鲁替尼和抗高血压药物贝尼地平。由于哌啶环上的氨基较为活泼，手性哌啶醇的N往往带有保护基团。在手性哌啶醇中，对(S)-N-Boc-3-哌啶醇的研究最为多见。(S)-N-Boc-3-哌啶醇化学名称为 (S)-1-叔丁氧羰基-3-哌啶醇，分子量201.2628 ，熔点 65～67 °C，CAS 号 143900-44-1。

此外，具有氮杂糖结构的多羟基哌啶类衍生物是治疗病毒感染（包括AIDS）、癌症和糖尿病的重要药物之一。

1.1 化学法合成手性哌啶醇

在化学合成中，可以从不同的起始原料合成手性3-哌啶醇。2001年Amat等人[3]先将N-苄基甘氨醇-四氢吡啶酮经间氯苯氧甲酸双键环氧化生成饱和二环羟基内酰胺，最后经硼烷四氢呋喃、氢氧化钯碳、二碳酸二叔丁酯等试剂作用下催化得 (S)-N-Boc-3-哌啶醇，产物总得率低，仅为7.66%。2007年Reddy等人[4]以4-甲基溴苯乙酮为原料，经多步化学反应后生成(S)-N-Boc-3-哌啶醇，该合成方法产物总得率仅为31.1%，反应过程繁琐、耗时长。2010年刘前以3-吡啶醇为原料，与溴化苄反应生成N-苄基-3-吡啶醇的季铵盐，再用镍基催化剂在3～5 atm氢气压力下催化还原得N-苄基-3-哌啶醇，产物收率达79%，纯度＞99%。这是目前合成N-烷基取代的哌啶类衍生物最为直接的路线，然而该方法的产物为消旋哌啶醇，还需要辅以手性拆分才能获得手性哌啶醇。2013年沈伟艺等人同样以3-吡啶醇(1)为原料，经5%铑炭催化加氢还原得消旋3-哌啶醇(2)，3-哌啶醇(2)经D-酒石酸衍生物(2S,3S)-N-(4-氯苯基)-2,3-二羟基丁酰胺酸(3)拆分，再在三乙胺作用下与二碳酸二叔丁酯 “一锅法”反应制得 (S)-NBoc-3-哌啶醇，总收率约为40%，合成路线如图1。

图1 (S)-N-Boc-3-哌啶醇(5)的合成路线

1.2 生物酶法合成手性3-哌啶醇

与化学法相比，对于生物法合成手性哌啶醇的研究为时尚短。研究者以羰基还原酶作为生物催化剂不对称还原哌啶酮生成手性哌啶醇，取得了较好的效果。2009年Lacheretz等人[5]利用胡萝卜整细胞不对称还原不同N-烷基取代的3-哌啶酮合成手性哌啶醇，其中对N-Boc-3-哌啶酮的催化效果最佳，得率73%，对映体过量值（e.e.值）为95%，但添加的底物浓度低（仅为2 mmol/L），且催化剂用量高达底物量的23%，尚不具备实际应用价值。2014年Ju Xin等人[6]从重组酶库中筛选获得对N-Boc-3-哌啶酮有活力的重组酶粉，以异丙醇为辅底物构建辅酶循环体系，催化初始浓度为5%的N-Boc-3-哌啶酮不对称还原，反应24 h后，反应得率为99.8%，e.e.值达93%。该哌啶酮还原酶催化特性与理想的生物催化剂还有一定差距，在工业催化上要求催化剂能同时满足如下要求：底物浓度＞100 g/L，催化剂用量＜5 g/L，反应时间＜24 h，转化率＞98%以及 e.e.值＞99%[7]。 因此，生物酶法在不对称合成手性哌啶醇上的应用仍需要更高效的生物催化剂。

2 手性奎宁醇

对手性奎宁醇合成的研究多集中于(R)-3-奎宁醇。(R)-3-奎宁醇化学名称为(R)-(-)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-醇，分子量 127.18，CAS号 25333-42-0。(R)-3-奎宁醇是毒蕈碱受体拮抗剂类药物的前体，可用于他沙利定、瑞伐托酯、索利那新、阿地溴铵等药物的合成[6]。

2.1 化学法合成手性奎宁醇

化学法合成 (R)-3-奎宁醇包括外消旋3-奎宁醇的选择性拆分和3-奎宁酮的不对称还原等方法。2009年李书彬等人[8]以硼氢化钾为还原剂，将3-奎宁酮还原为外消旋的3-奎宁醇，再用D-(+)-二苯甲酰酒石酸进行拆分，得到 (R)-3-奎宁醇，产物得率仅为20.4%，e.e.值98%。2009年Tsutsumi等人[9]使 用 RuBr2(xylskewphos)-(pica)金 属催化剂不对称氢化还原3-奎宁酮生成 (R)-3-奎宁醇，在4.3 kg反应体系中产物e.e.值可达87%。2010年该课题组对金属催化剂进行了改进，产物e.e.值提高至98%。2012年任彦荣采用CBS手性催化剂一步得到(R)-3-奎宁醇，e.e.值＞98%，收率达92%，步骤简单，合成路线如图2。

2.2 生物酶法合成手性奎宁醇

图2 (R)-3-奎宁环醇(3)的合成路线

生物法利用奎宁酮还原酶不对称还原奎宁酮生成(R)-3-奎宁醇，相关研究集中于高效奎宁酮还原酶的发现以及高效辅酶循环系统的构建。2009年Uzura等人[10]从Rhodotorula rubra JCM3782中克隆得到一个NADPH依赖的3-奎宁酮还原酶基因，在大肠杆菌中与葡萄糖脱氢酶基因共表达，以冻干菌体作催化剂，在3-奎宁酮初始浓度618 mmol/L下反应 2 h，产率达 98.6%，e.e.值＞99.9%。但是该酶对底物的亲和力低，Km值高达145 mmol/L。 2012年 Isotani等人[11]从 Microbacterium luteolum JCM 9174分离得到两个NADH依赖的还原酶QNR和bacC，并应用于不对称还原合成光学纯的(R)-3-奎宁醇。该酶法催化体系利用来自Leifsonia sp.的醇脱氢酶（LSADH）构建酶法偶联辅酶循环体系，并以异丙醇做第二底物。将含有重组bacC的大肠杆菌重组菌与含有LSADH的大肠杆菌重组菌用聚乙烯亚胺和戊二醛进行固定化并作为生物催化剂，隔8 h分批补料添加底物3-奎宁酮至10%（W/V），异丙醇至15%（V/V），48 h内能够完全转化 939 mmol/L 3-奎宁酮，产物e.e.值＞99.9%。2012年Wang Yu等人[12]从土壤中筛选到两株菌Nocardia sp.WY1202和Rhodococcus erythropolis WY1406，能够分别不对称还原奎宁酮生成光学纯的(R)-和(S)-3-奎宁醇。当底物浓度＞100 mmol/L时，野生菌整细胞催化得率下降，而e.e.值仍然为＞99%。2013年许建和等人报道了(R)-3-奎宁醇的酶法不对称合成工艺，在该工艺中底物奎宁酮浓度为242 g/L，催化剂用量为5 g/L，反应时间10 h，转化率和e.e.值均大于99%，时空得率更是高达916 g/(L·d)[7]，该工艺是迄今为止生物酶法合成(R)-3-奎宁醇的最高水平。尽管在生物酶法合成(R)-3-奎宁醇已经取得了可应用于工业催化的成果，研究者们仍然致力于发现新的奎宁酮还原酶。2014年Kolet等人[13]从30多株真菌中分离得到一株毛霉菌Mucor piriformis，该菌可以不对称还原底物生成（R)-3-奎宁醇，但是效果不佳，底物浓度低，反应时间长，e.e.值为 96%。

3 手性吡咯烷醇

在手性吡咯烷醇的合成方面，报道较多的是(S)-N-苄基-3-吡咯烷醇。(S)-N-苄基-3-吡咯烷醇的分子量177.24，CAS号101385-90-4。(S)-N-苄基-3-吡咯烷醇是合成治疗膀胱过度活动症的药物达非那新和抗高血压药物巴尼地平的关键中间体。

3.1 化学法合成手性吡咯烷醇

3-吡咯烷酮是合成天然抗肿瘤药物喜树碱的重要中间体，也是合成手性吡咯烷醇的前体，通过对3-吡咯烷酮的不对称还原可以得到手性3-吡咯烷醇。2002年韩小兵等人[14]以价廉易得的甘氨酸作为起始原料，与丙烯腈加成后，经水解酯化、酰化、成环、脱羧等5步反应合成了3-吡咯烷酮盐酸盐，总收率达到51.1%。此外，研究者也可以利用手性原料直接合成手性吡咯烷醇。2010年刘前等人[15]以L-苹果酸为手性原料，与乙酰氯反应生成(S)-2-乙酰基苹果酸酐，再与苄胺环合，经酯交换反应脱去乙酰基，再用三氟化硼-硼氢化钠还原化合物得(S)-N-苄基-3-吡咯烷醇，总收率为59%。2012年魏林等人的合成路线更为简单，将L-苹果酸与苄胺经无溶剂熔融反应缩合得到酰亚胺 (S)-N-苄基-3-羟基吡咯烷-2,5-二酮(1)，改用价格低廉、安全稳定的硼氢化钠在碘催化下还原得到(S)-N-苄基-3-羟基吡咯烷-硼烷复合物(2)，最后再甲醇作用下脱去硼烷得到(S)-N-苄基-3-吡咯烷醇(3)。合成路线如图3。

图3 (S)-N-苄基-3-吡咯烷醇(3)的合成路线

3.2 生物酶法合成手性吡咯烷醇

生物法合成3-吡咯烷醇包括脂肪酶催化的选择性拆分、单加氧酶催化的选择性羟基化以及羰基还原酶催化的不对称还原等方法。将酮底物经硼氢化钠还原为醇产物，醇经酰化后再用脂肪酶选择性拆分得到手性醇。脂肪酶催化的选择性拆分理论产率仅为50%，并且过程中涉及化学加氢还原及产物衍生化，相较而言氧化还原酶催化的不对称合成具有更大的优势。2010年Zhang Wei等人[16]克隆表达了来自于鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.HXN-200中的单加氧酶基因，该酶具有良好的区域及立体选择性，可以将N-Cbz-3-吡咯烷酮直接羟基化生成光学纯的 (R)-NCbz-3-吡咯烷醇。与单加氧酶催化的选择性羟基化反应相比，利用羰基还原酶催化的不对称还原合成手性3-吡咯烷醇报道更多。2002年Itoh等人[17]从一株棒状杆菌Corynebacterium sp.ST-10中分离得到一个NADH依赖的中链醇脱氢酶PAR，该酶底物谱广、立体选择性专一，能够在24 h内转化5%浓度的N-Boc-3-吡咯烷酮，产物得率达85%，e.e.值＞99%。2005年，同课题组通过组合回复突变改造该酶，其突变体PAR268可以在5%～25%异丙醇存在下将底物完全转化，显著地提高了酶的溶剂耐受性，从而提高了底物转化率[18]。2007 年 Yamada-Onodera 等人[19]从头状地霉菌Geotrichum capitatum JCM 3908中克隆得到一个NADH依赖的N-Boc-3-吡咯烷酮还原酶，经诱导表达后该酶比活力为0.56 U/mg。将含有该吡咯烷酮还原酶的大肠杆菌重组菌与表达了葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌重组菌混合进行整细胞催化，在不添加NADH情况下，1 h内可将30 mmol/L底物完全转化生成S构型的醇，e.e.值＞99.9%。2008年Kizaki等人首次报道了可以合成光学纯的(R)-N-苄基-3-吡咯烷醇的短链醇脱氢酶。该酶来自于核黄素德沃斯氏菌Devosia riboflavina KNK10702，纯酶活力不高，仅为3.12 U/mg。目前生物法合成手性3-吡咯烷醇尚达不到工业应用水平。

4 小结与展望

手性含氮饱和杂环醇是一类重要的药物中间体，可以通过化学法和生物法合成。化学法可以利用廉价易得的原料合成含氮杂环酮，再通过前体酮的不对称氢化得到手性含氮饱和杂环醇，也可以利用手性原料通过多步反应直接合成手性含氮饱和杂环醇。化学催化的反应适用于高底物浓度，反应速率和产物得率均较高。然而，在化学法中前体酮的氢化生成手性醇需要在加温、加压设备中进行反应，设备要求和生产能耗高，反应过程具有一定的危险性。此外，化学法在手性催化中立体选择性较低，或者使用的重金属催化剂铑碳、二氧化铂等价格昂贵。与之相比，生物法具有反应条件温和、立体选择性强、副反应少和产物得率高等优点。化学法与生物酶法具有互补的优势，化学法与生物酶法相结合合成手性含氮饱和杂环醇应是行之有效的策略，利用化学法从廉价易得的原料合成前体含氮饱和杂环酮，然后通过生物酶法不对称合成高光学纯度的手性含氮饱和杂环醇。生物法合成手性含氮饱和杂环醇包括脂肪酶催化的选择性拆分、单加氧酶催化的选择性羟基化和羰基还原酶催化的不对称还原等，其中又以羰基还原酶催化的不对称还原法最有成效。羰基还原酶催化的酶反应需要高效的生物催化剂和高效的辅酶循环系统。除了个别极为成功的案例外，目前研究报道的生物催化剂在催化活性、底物及有机试剂耐受性、稳定性、可重复利用性等方面离工业催化的要求尚有较大距离。因此，后续研究不仅仅需要发现更高效的生物催化剂，还需要利用基因工程和蛋白质工程等技术快速而有效地改造酶的催化特性，从而满足工业化生产的需求。

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