响应曲面法优化rmHSA-GCSF的发酵工艺

单剑峰，刘晓妮，戎亚雯，张 昕，郭旺明，王同映

（杭州九源基因工程有限公司，浙江 杭州 310018）

重组人粒细胞集落因子（rhGCSF）[1]，在肿瘤放化疗引起的粒细胞减少症、再生障碍性贫血、放射病等血液病的治疗及骨髓移植方面具有重要作用，但hGCSF在血浆中的半衰期较短，需要多次给药。而人血清白蛋白（HSA）作为人体血清中的主要成分，分子量65 kD，是一种非糖基化蛋白，肾清除率非常低，对维持体内渗透压和血浆体积起着至关重要的作用，体内半衰期为14～20 d。因此治疗性蛋白和人血清白蛋白融合表达技术是长效蛋白药物的重要技术手段之一[2]。英国葛兰素史克公司成功开发了治疗II型糖尿病的胰高血糖样肽素-1/人血清白蛋白融合蛋白 （GLP-1/HSA,albiglutide），并于 2014年 4月获得美国FDA批准上市[3]。

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达外源蛋白是近几十年来非常流行的方法[4]，该系统带强启动子AOX1，受甲醇严格调控，具有目的产物分泌表达、后续分离纯化简便等优点。王昌梅等[5]利用毕赤酵母表达系统成功实现了rHSA-hGCSF的高效表达，通过食蟹猴体内实验表明rHSA-hGCSF的半衰期为hGCSF单体的15～20倍。但后续研究发现hGCSF存在一个O-糖基化位点，毕赤酵母会对目标蛋白进行糖基化修饰，与哺乳动物的糖基化修饰有差异，可能产生不同的药物蛋白代谢动力学性质，引起异常免疫反应。因此，杭州九源基因工程有限公司对rHSA-hGCSF融合蛋白进行改造和突变，成功构建出无糖基化的rmHSA-GCSF的表达载体。本文通过响应曲面分析法（RSM）来优化rmHSA-GCSF的摇瓶表达工艺参数，并在此基础上进行了150 L发酵罐工艺验证，以实现rmHSA-GCSF的高效表达。

1 材料与方法

1.1 菌种及试剂

Pichia pastoris酵母 GS115（Mut+）菌株为复旦大学李育阳教授惠赠；rmHSA-GCSF表达载体为pPIC9，由杭州九源基因工程有限公司自行构建；酵母粉购自英国OXIOD公司；YNB购自美国BD公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 培养基配方

1.2.1 种子培养基

YPD：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%。

BMGY：酵母粉1%，蛋白胨2%，YNB（不含氨基酸）1.34%，1 mmol/L 磷酸钾缓冲溶液（pH 6.0），生物素4×10-5%，甘油1%。

BMMY：酵母粉1%，蛋白胨2%，YNB（不含氨基酸）1.34%，1 mmol/L磷酸钾缓冲溶液 （pH变化），生物素 4×10-5%，甲醇适量。

1.2.2 发酵培养基

基础盐培养基（FBS，Invitrogen）：H3PO4（85%）26.7 mL，CaSO4·2H2O 0.93 g，K2SO418.2 g，Mg-SO4·7H2O 14.9 g，KOH 4.13 g，甘油 40 g，微量盐溶液4.4 mL，用去离子水加至1 L。

微量盐溶液（PTM1）：FeSO4·7H2O 65 g，ZnSO442.19 g，CuSO4·5H2O 6.0 g，MnSO4·H2O 3.0 g，Co-Cl2·6H2O 0.5 g，NaMoO4·2H2O 0.2 g，NaI 0.08 g，H3BO30.02 g，生物素 0.2 g，浓硫酸 5 mL，用去离子水加至1 L，过滤除菌。

1.3 方法

1.3.1 摇瓶工艺方法

将酵母菌株从甘油冻存管中划线于YPD平板上，于30°C培养箱静止培养2 d进行活化。取适量活化好的菌体接种于含50 mL BMGY的250 mL锥形瓶中，置于300 r/min、30°C摇床振荡培养约24 h。再取适量培养好的菌悬液按一定接种量转接至BMGY中，继续震荡培养过夜。将培养好的种子液按实验设计方案进行分装，无菌离心，换上一定量的不同pH缓冲液的BMMY，置摇床振荡培养，每隔24 h添加适量甲醇，诱导一定时间后取样，10000 r/min 离心 1 min，留上清，-20 °C 冻存。

1.3.2 发酵工艺方法

发酵培养基初始体积为60 L，按5%接种量上罐，培养阶段温度为30°C，pH 5.0，溶氧40%。等甘油耗尽（溶氧突然跃升）即可进行甘油流加，50%甘油（含 12 mL/L PTM1）以 24 mL/(L·h)的速率进行补加适量时间，饥饿0.5 h左右，等溶氧和pH均明显上升后，开始流加100%甲醇 （含12 mL/L PTM1）诱导，诱导条件按摇瓶优化好的参数进行。

1.3.3 分析方法

1）蛋白电泳：参照《蛋白质技术手册》进行[6]，浓缩胶5%，分离胶10%，考马斯亮蓝R-250染色观察。

2）蛋白浓度测定：利用ImageMaster VDS图像处理系统扫描蛋白电泳凝胶，用已知浓度的标准品做标准曲线，测定上清液中粗蛋白含量。

2 结果与讨论

2.1 Plackett-Burman设计法[7]

Plackett-Burman设计法是一种两水平的试验设计方法，它可以用最少的试验次数使各因素的主效应得到尽可能精确的估计，从众多考察因素中快速筛选出显著性因素，以供进一步研究。本试验选用实验次数n=12的设计，对8个因素进行考察。每个因素取两个水平，低水平“-1”为原始培养条件，高水平“1”取低水平的1.2～2倍，响应值为蛋白表达量（Y），采用MINITAB软件，得到实验设计方案（表1），并对结果分析，得到各因素效应（表 2）。

表1 Plackett-Burman实验设计因素水平

表2 实验结果及评价

从结果中可以看到，P值小于0.05的因素有诱导pH、甲醇添加浓度及诱导时间，表明此3种因素对rmHSA-GCSF表达有着显著性影响，可以进入下一步响应面（RSM）实验。

2.2 响应曲面分析优化各影响因子

在Plackett-Burman实验基础上，选取诱导pH、甲醇添加浓度和诱导时间3个因素为研究对象，采用Box-Behnken实验设计对rmHSA-GCSF表达进行3因素3水平上的响应面分析实验，包括12个析因试验和3个中心试验。设3个因素：初始诱导 pH（X1）、甲醇添加浓度（X2）、诱导时间（X3）为自变量，rmHSA-GCSF 表达量 Y（mg/L）为响应值，利用MINITAB软件设计了试验方案（表3），并对实验结果进行了分析（表4）。

表3 3因素3水平的Box-Behnken试验设计方案

表4 Box-Behnken实验结果

根据实验结果，采用逐步回归的方法进行二次回归分析（见表5），剔除影响不显著的因子，得到以下回归方程式：

对该方程求极值，得到X1=5.54，X2=2.45，X3=66.4，即诱导pH为 5.54，甲醇添加浓度为2.45%，诱导时间为66.4 h，在此条件下最佳理论值为157.5 mg/L，各因素响应曲面图见图1，从图中可以看出诱导pH、甲醇添加浓度和诱导时间与蛋白表达量之间的相关性。pH和诱导时间，pH和甲醇添加浓度两者之间交互不显著；而甲醇添加浓度和诱导时间两者交互显著，当诱导时间不变，甲醇添加浓度增加，蛋白表达量增大。当诱导时间62～70 h，甲醇添加浓度2.30%～2.60%时，蛋白表达量达到最佳范围。

表5 回归分析结果

图1 各因素交互影响曲面图

根据得到的优化结果进行摇瓶验证，rmHSAGCSF 表达量为（156.3±1.1）mg/L，与理论值偏差较小，说明本实验范围内建立的二次回归模型准确有效。

2.3 150 L发酵罐工艺验证结果

根据摇瓶工艺，指导150 L全自动发酵罐放大试验。酵母细胞利用甘油生长菌体阶段各参数基本不变，pH 5.0，温度30°C，溶氧控制40%以上；诱导阶段各参数为诱导pH 5.54，温度30°C，甲醇初始添加浓度为2.45%，溶氧控制40%以上，诱导时间为66.4 h。通过该工艺rmHSA-GCSF得到显著表达，表达量达600 mg/L左右，连续三批发酵的SDS-PAGE电泳结果见图2。

3 小结

响应曲面法（RSM），是数学方法和统计方法相结合的产物，它包括实验设计、建模、因子效应评估及寻求因子最佳操作条件，是用来对所感兴趣的响应受多个变量影响的问题进行建模和分析，能以很少的实验数量和时间优化，取得明确、有目的的结论[8]。MINITAB以其简洁的操作界面和强大的统计功能已经成为统计领域的常用方法[9]，借助该软件，响应面分析就变得轻而易举。

图2 连续三批150 L罐发酵的SDS-PAGE电泳结果

由于时间及发酵罐设备等的一些原因，直接在罐上进行工艺优化将花费大量的人力和物力，因此在摇瓶的基础上指导上罐是必需的，本文通过在摇瓶中各参数的RSM优化，得到一些明确的信息，如蛋白表达的最佳pH。如要达到蛋白高表达就需要延长诱导时间，但诱导时间过长，蛋白降解的风险就会增加，在此基础上，通过分批补料的方式，成功在150 L发酵罐上放大，实现rmHSAGCSF的高效表达。

[1]何磊，于凤波，王永峰，等．粒细胞集落刺激因子在大肠杆菌中表达的研究进展[J]．天津药学，2011，23(2)：57-59．

[2]郑炜，李杰．人血清白蛋白融合技术研究进展[J]．长沙大学学报，2013，27(5)：10-13．

[3]CEREGHINO J L,CREGG J M.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMS Microbiology Reviews,2000,24(1):45-66.

[4]TRAYNOR K.Albiglutide approved for type 2 diabetes[J].American Journal of Health-System Pharmacy,2014,71(11):888.

[5]王昌梅，王同映，杨志愉，等．重组HSA-hG-CSF融合蛋白在毕赤酵母中的表达[J]．中国生物工程杂志，2006，26(12)：34-39．

[6]汪家政，范明．蛋白质技术手册[M]．北京：科学出版社，2000．

[7]张锋华，许煜泉，张雪洪．采用响应面分析法优化吩嗪-1-羧酸的发酵条件[J]．现代农药，2007，6(2)：15-18．

[8]闵亚能．实验设计（DOE）应用指南[M]．北京：机械工业出版社，2011．

[9]王银存，王卫卫，李利军,等。响应面法优化葡糖醋杆菌产细菌纤维素的发酵工艺[J]．中国造纸学报，2012，27(2)：45-49．