常用抗菌药物对常见致病菌L型诱导的实验研究

尹秀华，王丽波，陶梅花，樊园绒，高升群，向仕辉，郭利军

（大理学院公共卫生学院，云南大理　671000）

常用抗菌药物对常见致病菌L型诱导的实验研究

尹秀华，王丽波，陶梅花，樊园绒，高升群，向仕辉，郭利军*

（大理学院公共卫生学院，云南大理671000）

目的：探讨临床常用抗菌药物对常见致病菌L型的实验室诱导作用，为临床诊治提供科学依据。方法：利用纸片弥散法和试管稀释法，分别对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、痢疾志贺菌进行L型菌的抗菌药物实验室诱导。结果：头孢唑林、头孢哌酮、氨苄西林、哌拉西林、左氧氟沙星均可不同程度诱导铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、痢疾志贺菌形成相应的L型细菌，相同条件下金黄色葡萄球菌L型未诱导出。结论：部分抗菌药物在一定条件下能使某些细菌失去细胞壁转为L型菌，继而发生生物学性状的改变，临床诊断治疗时应给予重视。

抗菌药物；细菌L型；实验室诱导

［DOI］10．3969∕j．issn．1672-2345．2015．02．006

细菌细胞壁的肽聚糖结构受到理化或生物因素的直接破坏或合成被抑制，这种细胞壁受损的细菌在高渗环境下仍可存活称为细菌细胞壁缺陷型。因其首先在Lister研究院发现而得名细菌L型。目前不合理抗生素导致细菌失去细胞壁转变为L型菌已经成为某些疾病反复发作或迁延不愈的重要原因，人工诱导形成L型细菌的因素有很多〔1-2〕，如抗菌药物、溶酶体等。本实验采用了6种临床常用的抗菌药物，在实验室条件下对4种常见感染性致病菌进行细菌L型诱导，现将结果报道如下。

1　材料和方法

1．1材料

1．1．1菌种金黄色葡萄球菌ATCC 25923、铜绿假单胞菌ATCC 27856、大肠埃希菌ATCC 25922、痢疾志贺菌，均由大理学院病原生物学综合实验室提供。

1．1．2抗菌药物头孢唑林（哈药集团制药，批号：H23020946）；头孢哌酮（昆明积大制药，批号：H20033229）；氨苄西林（山东鲁抗医药，批号：H19993032）；哌拉西林（四川制药，批号：H20061108）；左氧氟沙星（四川科伦药业，批号：H20044291）；罗红霉素胶囊（江苏联环药业，批号：H20055965）。

1．1．3药敏试验纸片头孢唑林（30 μg）、左氧氟沙星（30 μg）、罗红霉素（15 μg）药敏纸片，以上药敏纸片均由北京天坛药物生物技术开发公司提供；氨苄西林（10 μg）、哌拉西林（100 μg）、头孢哌酮（75 μg）3种抗菌药物的纸片均按抗菌药物敏感性试验纸片扩散法制备〔3〕。

1．1．4培养基采用姜孝新〔4〕报道的改良细菌L型培养基L2型：优质蛋白胨20 g、牛肉膏30 g、氯化钠50 g、蔗糖50 g、灭活小牛血清200 mL、1 mol∕L MgSO410 mL、蒸馏水800 mL、pH 7．4～7．6，固体培养基再加入琼脂8 g。

1．2细菌L型的诱导

1．2．1方法L型菌固体琼脂培养基诱导法：采用药物敏感试验纸片弥散法进行诱导，逐日观察抑菌圈内及边缘生长物菌落形态及涂片革兰染色细菌形态，连续2～3代出现典型L型菌落特征和∕或镜下特征为诱导成功〔5〕；L型菌液体培养基诱导法：在液体培养基中的诱导采用试管稀释法〔6-8〕，浓度选择参考文献〔9〕最小抑菌浓度判断标准，起始浓度选用判断为耐药的最低浓度前移一个浓度。分别为：头孢唑林（64 μg∕mL）、左氧氟沙星（16 μg∕mL）、罗红霉素（4 μg∕mL），氨苄西林（大肠埃希菌、痢疾志贺菌、铜绿假单胞菌64 μg∕mL，金黄色葡萄球菌2 μg∕mL）、哌拉西林（大肠埃希菌、痢疾志贺菌、铜绿假单胞菌256 μg∕mL，金黄色葡萄球菌64 μg∕mL）、头孢哌酮（128 μg∕mL）。采用药敏试验试管稀释法做6个浓度，设置一个不含抗菌药物的对照，24 h后分别取各浓度培养液涂片革兰染色油镜检查，连续观察2～3 d。

1．2．2结果判定低倍镜观察L型菌落典型特征：“油煎蛋”状、颗粒状、丝状菌落；革兰染色油镜下L型菌典型特征：多形性、巨球型、长丝状或长杆状；革兰染色油镜下出现典型特征为诱导成功。

2　结果

2．1细菌L型典型菌落的形成本次实验在细菌诱导2～3代过程中，在纸片弥散法抑菌圈内或交界处发现铜绿假单胞菌有细菌L型颗粒状菌落、“油煎蛋”样菌落，其余细菌菌落特征不明显。见封三图1～2。

2．2不同细菌形成L型菌落后的形态变化培养物涂片革兰染色后镜检，可见长杆状、长丝状、球状L型细菌典型特征；痢疾志贺菌、大肠埃希菌涂片后镜下可见大量长丝状、少量支端膨大和串珠状改变。见封三图3～5。铜绿假单胞菌在平板法诱导中细丝状改变。见封三图6。稀释法中为长丝状改变。见封三图7。

2．3不同抗菌药物两种培养方法诱导产生L型菌结果见表1。

3　讨论

多种细菌在某些理化因素作用下可以转变为L型，由于细菌细胞壁缺损，与原菌比较细菌L型形态、染色性质、培养特性、生化反应、耐药性等生物学性状发生改变，加之临床症状不典型难以作出正确的诊断和治疗。但是，多数细菌L型仍具有一定的致病能力，在机体免疫力降低时，影响因素减弱或消除后它又能恢复而使疾病复发、恶化。目前研究发现它可引起多种感染性疾病，如呼吸道感染、消化系统感染、泌尿系感染等，且由于转变为L型菌后致病力降低易于被忽略〔4，10〕。而针对临床感染性疾病而言，抗菌药物则是引发细菌转变为L型的重要因素，本次实验也证实这一点。在实验中所使用的头孢唑林、头孢哌酮、氨苄西林、哌拉西林、左氧氟沙星、罗红霉素都是目前常用的抗菌药物，菌种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、痢疾志贺菌也是常见引起临床感染性疾病的病原体，除罗红霉素之外的其余抗菌药物都能使部分细菌发生L型转变，其中大肠埃希菌和痢疾志贺菌能被头孢唑林、头孢哌酮、氨苄西林、哌拉西林、左氧氟沙星诱导产生L型菌，铜绿假单胞菌能被头孢哌酮和哌拉西林诱导产生L型菌；以往研究多认为影响细菌细胞壁合成的抗菌药物是诱导产生L型菌的主要抗菌药物，但本次实验中喹诺酮类抗菌药物左氧氟沙星也能诱导出大肠埃希菌和痢疾志贺菌的L型，而此类抗菌药物目前广泛应用于临床多系统的感染性疾病，需引起重视。金黄色葡萄球菌在本次实验中未诱导出L型，可能与实验条件有关，但研究发现金黄色葡萄球菌L型临床较常见〔10〕，同样应引起重视。

表1　不同抗菌药物两种培养方法诱导产生L型菌

〔1〕Dienes L，Weinberger H J．The L-froms of bacteria〔J〕．Bacter-Ological Reviews，1951，15（4）:245-288．

〔2〕Allan E J，Hoischen C，Gumpert J．Bacterifal L-Forms〔M〕．San Diego:Elsevier Academic Press INC，2009．

〔3〕俞树荣．微生物学和微生物学检验〔M〕．北京：人民卫生出版社，1997:452．

〔4〕姜孝新，杨祚升．改良细菌L型培养基的临床应用〔J〕．南华大学学报，2001，29（5）:477-478．

〔5〕黄谷良，林特夫．细菌L型与疾病〔M〕．北京：学苑出版社，1991:49-60．

〔6〕倪语星，尚红．临床微生物学与检验〔M〕．北京：人民卫生出版社，2007:60-61．

〔7〕李杨，罗廷顺，代欣桃，等．天南星提取物的抑菌作用研究〔J〕．大理学院学报，2014，13（2）:9-11．

〔8〕耿玲，陈俊雅，李洪文，等．紫地榆提取物体外抗菌活性研究〔J〕．大理学院学报，2014，13（10）:14-17．

〔9〕卫生部卫生监督中心卫生标准处．临床检验标准汇编〔M〕．北京：中国标准出版社，2004:108-123．

〔10〕于守平，葛晨霞．细菌L型的形成机制与特性〔J〕．中国兽药杂志，2009，43（8）:42-45．

（责任编辑李杨）

Experimental Study on Inductive Effects of Antibiotics on the Common Pathogenic L-form Bacteria

Yin Xiuhua,Wang Libo,Tao Meihua,Fan Yuanrong,Gao Shengqun,Xiang Shihui,Guo Lijun*
（College of Public Health,Dali University,Dali,Yunnan 671000，China）

Objective:To explore laboratory inductive effects of the commonly used clinical antibiotics on the common pathogenic L-form bacteria and to provide a scientific basis for clinical diagnosis and treatment．Methods:With the paper dispersion method and tube dilution method,Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa,E.coli and Shigella were induced by antibiotics in the laboratory．Results:Cefazolin,cefoperazone,ampicillin,piperacillin and levofloxacin could induce Pseudominas aeruginosa,E.coli and Shigella to some degree to form corresponding L-form bacteria．L-form Staphylococcus aureus under the same condition wasn′t induced．Conclusion:Some antibiotics under certain conditions could make some bacteria lose cell walls and become L-form bacteria,and then change their biological characteristics,which the clinical diagnosis and treatment should attach importance to．

antibiotics;L-form bacteria;the laboratory induction

R37

A

1672-2345（2015）02-0021-03

大理学院大学生科研基金资助项目（KYSX2013005）

2014-10-05

2014-11-25

尹秀华，预防医学专业2010级本科生．

郭利军，高级实验师．