乳香提取物抑制裸鼠胰腺癌生长的作用及机制研究

倪　效，梁晓强，张静喆

乳香提取物抑制裸鼠胰腺癌生长的作用及机制研究

倪效，梁晓强，张静喆

目的:研究乳香提取物体内抑制胰腺癌的可能性及其机制。方法:利用人胰腺癌细胞株MIA PaCa-2体外扩增后种植于裸鼠皮下成瘤，将乳香提取物经裸鼠皮下注射，同时设PBS组为对照，观察肿瘤体积变化（其中乳香提取物治疗组6只，对照组5只），12 d后将肿瘤切除后测量肿瘤体积，固定瘤体后切片，通过标记磷酸化组蛋白H3（PHH3）,原位末端转移酶标记技术（TUNEL）行免疫组化分析。结果:治疗组肿瘤体积为（76.67±24.11）mm3，对照组肿瘤体积为（204.80±101.19）mm3；治疗组PHH3阳性细胞数为197.5±40.4，对照组PHH3阳性细胞数为252.8±30.6；治疗组TUNEL阳性细胞数为316.7±117.3，对照组为TUNEL阳性细胞数为100.6±47.2；治疗组与对照组比较，P＜0.05。结论:乳香提取物在体内可以抑制裸鼠胰腺癌的生长，促进胰腺癌细胞的凋亡。

乳香；胰腺癌；凋亡；裸鼠

胰腺癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，其恶性程度高，进展快，具有发现晚，病程短，转移早，预后差等特点。近数十年来，其发病率在全球范围内呈逐渐升高的趋势[1]。中医药学在肿瘤的预防和治疗中，既考虑到整体，又考虑到局部，在某些方面有着其他疗法所不及的优点。中药名方西黄丸往往用于晚期肿瘤病人，现代医学认为其主要中药成分乳香有抗肿瘤作用，对其进行了一系列研究，然而在抑制胰腺癌方面的研究较少。本课题拟研究乳香提取物精油在裸鼠胰腺癌能否抑制肿瘤生长，为今后研究打下基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1乳香提取物乳香提取物精油由美国俄克拉荷马州健康医学中心HK-Lin教授提供，通过水蒸馏冷凝法获得，密闭，避光保存于室温。

1.1.2胰腺癌细胞株胰腺癌细胞株MIA PaCa-2购自上海中科院细胞库,培养基为含10%小牛血清的RPMI-1640，培养条件为5%CO2，37℃，隔天换液。

1.1.3动物裸鼠购自中国科学院，4～6周龄，雄性，均为20 g左右。无菌条件,上海中医药大学附属龙华医院中心动物房代为饲养。

1.1.4免疫组化抗体及材料一抗兔抗小鼠PHH3,羊抗兔二抗购自美国Santa Cruz公司。原位末端转移酶标记技术（TUNEL）测试试剂盒购自美国强生公司，Matrigel购自美国强生公司。

1.2实验方法

1.2.1胰腺癌裸鼠移植瘤模型将胰腺癌细胞MIA PaCa-2大量扩增，接种于裸鼠背部皮下，接种细胞总量为2.5×106，与含10%Matrigel的PBS 0.2 mL混合，Matrigel使用前冻融，置于冰上。接种时观察细胞处于对数生长期，细胞活力良好。

1.2.2乳香精油治疗实验胰腺癌细胞接种于裸鼠皮下1周后测肿瘤体积，随机分为2组（其中乳香提取物治疗组6只，对照组5只）。取乳香提取物30 μL皮下注射，皮下注射等量PBS作为对照，每4 d 1次，每次注射前测量肿瘤体积，肿瘤体积按照最长径×最宽径的平方×0.52公式计算。注射3次后将裸鼠乙醚麻醉后处死，照相，测肿瘤体积。离体肿瘤体积按照（长×宽×高）×0.52公式计算。

1.2.3肿瘤标本免疫组化将所取标本甲醛固定后石蜡包埋切片，以5 μm厚薄切片，按免疫组化步骤进行染色。PHH3一抗浓度1∶400，一抗4℃过夜。TUNEL按照试剂盒操作步骤操作，Fast Red显色。

1.2.4PHH3、TUNEL阳性细胞计数随机抽取肿瘤组织石蜡切片两片，40倍放大倍数观察阳性细胞数，每片石蜡切片以20个随机视野（两片40个随机视野）的总和计算阳性细胞数。

1.3统计分析应用SPSS11.0软件进行数据处理。计量资料用均数±标准差(±s)表示，采用独立样本t检验分析。P＜0.05表示有统计学意义。

2　结果

2.13次注射后肿瘤体积变化每4 d注射1次，3次注射后对照组肿瘤体积从（118.60±31.50）mm3增加到（402.00±143.27）mm3。治疗组肿瘤体积从第8 d的（229.50±130.70）mm3减小到第12 d的（212.50± 120.50）mm3，治疗组肿瘤生长呈下降趋势。对照组离体肿瘤体积为（204.80±101.19）mm3，治疗组离体肿瘤体积为（76.67±24.11）mm3。如图1、表1所示。

表1　每4 d注射乳香提取物肿瘤体积变化比较（±s）

表1　每4 d注射乳香提取物肿瘤体积变化比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05

组别对照组乳香提取物组n5 6 0 d（mm3）118.60±31.50 130.67±45.52 4 d（mm3）146.20±53.63 165.16±51.32 8 d（mm3）259.80±68.08 229.50±130.70 12 d（mm3）402.00±143.27 212.50±120.50a离体（mm3）204.80±101.19 76.67±24.11a

图1　裸鼠皮下成瘤后皮下注射乳香提取物，每4 d 1次，每次30 μL，第3次注射后肿瘤体积呈缩小趋势，有统计学差异（P＜0.05）。离体肿瘤体积有统计学差异（P＜0.05）

2.23次注射后肿瘤体积百分比变化每4 d注射1次，3次注射后对照组肿瘤体积增加百分比分别为（20.54±17.31）%、（124.10±61.67）%、（239.32± 102.25）%。治疗组3次注射后肿瘤体积增加百分比分别为（32.73±50.48）%、（66.54±54.06）%、（56.78± 50.19）%，第3次注射后肿瘤体积增加百分比比较有显著差异(P＜0.05)。如表2所示。

2.3胰腺肿瘤免疫组化分析磷酸化组蛋白H3（PHH3）抗体，能够特异地检测到10位或28位的丝氨酸被磷酸化的组蛋白。这个磷酸化过程在细胞间期几乎不发生，而仅发生在有丝分裂期，而且细胞凋亡时组蛋白不发生磷酸化。PHH3可作为一个有效的细胞有丝分裂标记抗体[2]。对照组PHH3阳性细胞数为252.8±30.6，治疗组PHH3阳性细胞数为197.5±40.4，二者比较有差异(P＜0.05)。

凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3'-OH末端，TUNEL通过在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3'末端，从而进行凋亡细胞的检测[3]。对照组TUNEL阳性细胞数为100.6±47.2，治疗组TUNEL阳性细胞数为316.7±117.3，二者比较有差异，如图2、表3所示。

表2　3次注射后肿瘤体积百分比变化比较（±s，%）

表2　3次注射后肿瘤体积百分比变化比较（±s，%）

注：与对照组比较,aP＜0.05

组别对照组乳香提取物组n5 6第1次注射(%) 20.54±17.31 32.73±50.48第2次注射(%) 124.10±61.67 66.54±54.06第3次注射(%) 239.32±102.25 56.78±50.19a

图2　胰腺肿瘤切片行免疫组化分析

表3　胰腺肿瘤PHH3,TUNEL免疫组化比较（±s）

表3　胰腺肿瘤PHH3,TUNEL免疫组化比较（±s）

注：与对照组比较,aP＜0.05

组别对照组乳香提取物组n5 6 PHH3 252.8±30.6 197.5±40.4aTUNEL 100.6±47.2 316.7±117.3a

3　讨论

2010年全世界新发胰腺癌病例预计已达到293541例[4]，胰腺癌恶性程度很 高，患者平均存活期少于6个月。美国国立卫生研究院报告，胰腺癌1年生存率为8%，5年生存率为3%，我国外科的统计资料显示，5年生存率在5%左右。由于胰腺癌的早期诊断率低，确诊时仅有12%～15%的患者有手术切除的机会，在这些“幸运”的患者中约有50%在短期内死于局部复发和远处转移[5]。80%以上的胰腺癌患者确诊时只能行探查或姑息性手术，单一放疗或化疗的治疗效果不理想，预后极差[6]，而中晚期患者经常出现不同程度的疼痛。因此寻找一种能有效抑制胰腺癌特别是抑制其生长转移，提高生活质量的药物意义重大。

乳香是一种含挥发油的胶质树脂，从东非或阿拉伯产的乳香属树木中取得，为橄榄科植物卡氏乳香树胶树脂，主产索马里、埃塞俄比亚。祖国医学对乳香早有运用,其性辛、苦、温，入心、肝、脾经，能活血，行气、止痛，治瘀阻气滞的脘腹疼痛，风湿痹痛,跌打损伤，痛经,产后腹痛。在其他国家，乳香也被用于一些炎症性疾病如Crohn病和包括风湿性关节炎在内的其他一些疾病。

现代医学认为，乳香的作用包括抗炎[7]、免疫调节[8-9]、抗细菌和抗真菌作用[10]。由于乳香的活血止痛作用,开始被用于肿瘤晚期的疼痛病人，尤其对于肿瘤晚期远处转移疼痛的病人。在肿瘤止痛过程中，人们开始发现，乳香及其提取成分有抗肿瘤作用，对其抗肿瘤作用及机制开始了研究。乳香的抗肿瘤作用在多种人肿瘤细胞系中得到证实，其中包括脑膜瘤细胞[11]、白血病细胞[12]、肝癌细胞[13]、黑色素瘤、纤维肉瘤[14]、大肠癌细胞[15]、前列腺癌细胞[16]。

本课题在前期研究基础上进一步进行体内实验,通过裸鼠皮下注射胰腺癌细胞MIA PaCa-2建立胰腺癌动物生长模型。乳香提取物皮下注射，3次注射后肿瘤体积大小变化有统计学差异。通过免疫组化分析处理组肿瘤细胞有丝分裂减少,肿瘤凋亡增加。证明乳香提取物在裸鼠可以抑制胰腺癌细胞生长,促进其凋亡。然而其发挥主要作用的化学成分，作用的具体机制还应进一步的研究阐明。

胰腺癌恶性程度高，进展快，在原来成熟技术的基础上我们开展了术前新辅助放化疗，手术后加放化疗，中药乳香作为近年来抗肿瘤研究热点，在各种肿瘤系中有不同的报道，但作为治疗胰腺癌几乎没有相关报道。德国Kirste等[17]将44位转移性脑癌接受放疗的患者随机分为两组，治疗组采用乳香提取物4200 mg/d口服治疗，MRI显示脑水肿差异程度有统计学意义。文章报道，其可能与乳香消除水肿作用有关更可能与其抗肿瘤作用有关。Kirste等的临床受试中除了轻微胃肠道反应外并无其他不良报道，从一定程度上反应了乳香提取物作为临床试验的安全性。乳香在祖国医学中运用广泛，抗肿瘤药西黄丸中就有乳香成分，除了一些过敏反应外也鲜见不良反应。乳香的抗肿瘤作用及其安全性，使我们有理由相信其治疗胰腺癌的可能。

[1]余志良，李兆申.胰腺癌流行病学研究进展[J].肿瘤防治杂志，2002,9(1)：7-9.

[2]Tapia C,Kutzner H,Mentzel T,et al.Two mitosisspecific antibod⁃ies,MPM-2 and phospho-histone H3(Ser28),allow rapid and pre⁃cise determination of mitotic activity[J].Am J Surg Pathol，2006, 30(1):83-89.

[3]Gavrieli Y,Sherman Y,Ben-Sasson SA，et al.Identification of pro⁃grammed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation[J].J Cell Biol，1992,119(3):493-501.

[4]Ferlay J,Shin HR,Bray F,et al.Estimates of worldwide burden of 3cancer in 2008:GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer,2010，127 (12):2893-2917.

[5]Brik D，Fortnagel G，Formentini A，et al.Small carcinoma of the pancreas．Factors of prognostic relevance[J].J Hepatobiliary Pan⁃creat Surg,1998，5(4):450-454.

[6]Lowenfels AB，Maisonneuve P.Epidemiology and risk factors for pancreatic cancer[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol，2006,20 (2)：197-209.

[7]Chevrier MR,Ryan AE,Lee DY,et al.Boswellia carterii extract in⁃hibits TH1 cytokines and promotes TH2 cytokines in vitro[J].Clin Diag Lab Immunol，2005,12(5):575-580.

[8]Sharma ML,Khajuria A,Kaul A,et al.Effect of salai guggal ex-Boswellia serrata on cellular and humoral immune responses and leucocyte migration[J].Agents Actions,1988,24(1-2):161-164.

[9]Singh GB,Atal CK.Pharmacology of an extract of salai guggal ex-Boswellia serrata,a new non-steroidal anti-inflammatory agent [J].Agents Actions,1986,18(3-4):407-412.

[10]Weckesser S,Engel K,Simon-Haarhaus B,et al.Screening of plant extracts for antimicrobial activity against bacteria and yeasts with dermatological relevance[J].Phytomedicine,2007,14(7-8): 508-516.

[11]Park YS,Lee JH,Bondar J,et al.Cytotoxic action of acetyl-11-ke⁃to-boswellic acid(AKBA)on meningioma cells[J].Planta Med, 2002，68(5):397-401.

[12]Shao Y,Ho CT,Chin CK,et al.Inhibitory activity of boswellic ac⁃ids from Boswellia serrata against human leukemia HL-60 cells in culture[J].Planta Med,1998,64(4):328-331.

[13]Liu JJ,Nilsson A,Oredsson S,et al.Keto-and acetyl-keto-bo⁃swellic acids inhibit proliferation and induce apoptosis in Hep G2 cells via a caspase-8 dependent pathway[J].Int J Mol Med,2002, 10(4):501-505.

[14]Zhao W,Entschladen F,Liu H,et al.Boswellic acid acetate in⁃duces differentiation and apoptosis in highly metastatic melanoma and fibrosarcoma cells[J].Cancer Detect Prev,2003,27(1):67-75.

[15]Liu JJ,Nilsson A,Oredsson S,et al.Boswellic acids trigger apop⁃tosis via a pathway dependent on caspase-8 activation but indepen⁃dent on Fas/Fas ligand interaction in colon cancer HT-29 cells [J].Carcinogenesis,2002,23(12):2087-2093.

[16]Pang X,Yi Z,Zhang X,et al.Acetyl-11-keto-boswellic acid in⁃hibits prostate tumor growth by suppressing vascular endothelial growth factor receptor 2-mediated angiogenesis[J].Cancer Res, 2009,69(14):5893-5900.

[17]Kirste S,Treier M,Wehrle SJ,et al.Boswellia serrata acts on cere⁃bral edema in patients irradiated for brain tumors:A prospective, randomized,placebo-controlled,double-blind pilot trial[J].Can⁃cer,2011,117(16):3788-3795.

（收稿：2014-09-20修回：2015-05-26）

（责任编辑王 丰屈振亮）

The Inhibitory Effect and Mechanism of Pancreatic Cancer in Nude Mice Model with Frankincense Extract

NI Xiao,LIANG Xiao-qiang，ZHANG Jing-zheDepartment of General Surgery,Long Hua Hospital Af⁃filiated Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai(200032),China

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect and mechanism of pancreatic cancer in nude mice model with Frankincense extract.MethodsMIA PaCa-2 of pancreatic cancer cell lines were implanted into nude mice subcutaneously.The nude mice were randomly assigned to receive either PBS(control)or Frankin⁃cense extract injection subcutaneously(the number of treatment group was 6,while the control group was 5).Af⁃ter 12 days,tumors were removed.Tumor volume were mersured.Tumors were fixed and immunohistochemical analysis for PHH3 and TUNEL.Results The tumor size of the treatment group was（76.67±24.11）mm3while the control group was（204.80±101.19）mm3.The difference is statistically significant(p＜0.05).The number of PHH3-immunoreactive cells of treatment group was(197.5±40.4),while the control group was(252.8±30.6).The difference is statistically significant(P＜0.05).The number of TUNEL positive cells in treatment group was (316.7±117.3),while the control group was(100.6±47.2).The difference is statistically significant(P＜0.05). Conclusion The Frankincense extract can inhibit the growth of pancreatic cancer in vivo of xenograft murine.

Frankincense;pancreatic cancer;apoptosis;nude mice

Q95-33;R735.9

A

1007-6948(2015)04-0376-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2015.04.012

上海中医药大学附属龙华医院普外科（上海 200032）

张静喆，E-mail:zjzzzq@sina.com