全自动高通量与半自动ELISA检测HBV血清标志物临床应用比较

沈 菁，徐如梅，范雪娇，陈 雯，伍严安

(福建医科大学省立临床医学院福建省立医院检验科，福建福州350001)

全自动高通量与半自动ELISA检测HBV血清标志物临床应用比较

沈 菁，徐如梅，范雪娇，陈 雯，伍严安

(福建医科大学省立临床医学院福建省立医院检验科，福建福州350001)

目的比较全自动高通量ELISA(全自动法)和半自动ELISA检测系统（半自动法）对HBV血清标志物结果的差异，探讨全自动ELISA检测系统的临床应用价值。方法对自2011年6月至2013年4月用半自动和2013年6月至2015年4月用全自动法检测HBV 5项血清标志物的数据进行回顾性研究。统计日常应用室内定值弱阳性质控S/CO值的CV值、失控率、失控原因以及临床标本的复检率、复检样本的符合率，并进行统计学分析。结果全自动法检测HBV 5项血清标志物室内质控S/CO值的CV值（24.66%、25.44%、23.8%、49.64%、70.14%）均小于半自动法（27.67%、34.32%、29.21%、54.88%、90. 6%）。失控率（0.99%、1.66%、1.32%、0.66%、0.5%）均小于半自动法（1.5%、1.82%、1.66%、1.0%、0.67%），但无明显差异（P＞0. 05）。日常标本的复检率（1.62%）明显小于半自动法（3.55%）（P＜0.01）。复检样本的符合率（55.37%）明显大于半自动法（42. 11%）（P＜0.01），特别是HBV血清标志物少见模式和HBsAg弱阳性样本的检测。结论全自动法检测HBV血清标志物的稳定性、重复性以及准确性均优于半自动法。

酶联免疫吸附试验；全自动法；半自动法；乙型肝炎病毒

乙型肝炎病毒(HBV，乙肝)感染是世界性公共卫生关注的焦点之一，被认为是病毒性肝炎最重要的一个原因[1]。根据WHO数据统计，世界上共有20亿人口曾感染HBV，我国感染HBV人数占全球感染人数的33%[2]。现阶段，临床实验室检测乙型肝炎病毒血清标志物的方法有多种，ELISA是临床应用最早且目前仍广泛使用的半定量检测方法，其灵敏度、准确性与重复性虽不及电化学发光免疫分析与时间分辨荧光分析技术[3]，但其具有检测成本低廉，成批检测时间消耗不长，设备仪器要求不高等优点。目前用ELISA方法检测乙型肝炎病毒5项血清标志物HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc (HBV-M）仍广泛应用于各个临床实验室。由于实验室条件不同，在操作上有手工、半自动和全自动等不同方法。这三种方法之间检测结果的差别以及对检验结果的影响值得研究，但相关报道较少。

本文对通过对本院2013年6月至2015年4月用全自动高通量ELISA法（全自动法）和2011年6月至2013年4月用半自动ELISA法（半自动法）检测HBV-M日常室内质控数据以及临床标本检测的复检情况进行回顾性分析，比较在长期临床检测中，全自动法与半自动法检测的重复性和准确性。

1 资料与方法

1.1 资料来源本院ELISA法检测HBV-M自2011年6月至2013年4月期间用半自动法的室内质控数据以及临床样本44984例；2013年6月至2015年4月期间用全自动法的室内质控数据以及临床样本48694例。

1.2 仪器与试剂全自动法：烟台艾德康生物科技有限公司产的Addcare ELISA 600高通量ELISA检测系统；半自动法：瑞士帝肯公司产的TECAN freedom EVO前处理系统和TECAN Sunrise酶标仪；PW-960多功能酶标洗板机；HH-W-600数显电热恒温水箱。试剂均采用英科新创（厦门）科技有限公司生产的ELISA试剂盒；室内质控品采用北京康彻斯坦生物科技有限公司生产的定值弱阳性质控（HBsAg0.2IU/ml、HBsAb30mIU/ml、HBeAg 2NCU/ml、HBeAb 4NCU/ml、HBcAb 4NCU/ml）。

1.3 方法⑴根据两检测系统在两期间内HBV-M每项目每日应用室内定值弱阳性质控的S/CO值计算其CV值；按本室SOP文件设12S、13S和1cutoff(+)为弱阳性质控品的质控规则（12S表示弱阳性质控的S/CO值超过x±2s判为警告，13S表示超过x±3s判为失控，1cutoff(+)表示弱阳性质控的S/CO值小于1为失控），设1cutoff(-)为阴性质控品的质控规则（1cutoff(-)表示阴性质控的S/CO值大于或等于1为失控），最后根据室内失控报告记录计算失控率并以失控原因进行分类统计。⑵为了便于表述，对HBV-M血清学阳性标志，按顺序编号：①HBsAg、②抗-HBs、③HBeAg、④抗-HBe、⑤抗-HBc。例如“135”表示：HBsAg阳性，抗-HBs阴性、HBeAg阳性、抗-HBe阴性、抗-HBc阳性，余类推。统计两期间内两检测系统检测HBV-M临床标本的复检率，并根据HBV-M血清学模式将需复检的标本进行分组，按初检和最终报告结果一致的为符合，计算每组中需复检标本的符合率。最后对数据进行统计学分析。

1.4 统计学处理采用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理，率的比较采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 全自动法与半自动法检测HBV-M室内定值弱阳性质控的S/CO值的CV值比较根据2013年6月至2015年4月用全自动法和2011年6月至2013年4月用半自动法检测HBV-M每日室内定值弱阳性质控的S/CO值，分别计算每项目的CV值，全自动法均小于半自动法。结果见图1。

图1 全自动法与半自动法室内质控CV值（%）

2.2 全自动法与半自动法检测HBV-M室内质控失控率的比较根据2013年6月至2015年4月用全自动法和2011年6月至2013年4月用半自动法检测HBV-M的室内失控报告记录，分别计算每项目的失控率，全自动法均小于半自动法，但无明显差异（P＞0.05），结果见表1。以失控原因分类，人为因素全自动法占28.6%(8/28)，半自动法占60%（24/ 40）；仪器因素全自动法占50%(14/28)，半自动占32.5%（13/40）；试剂因素全自动法占14.3%(4/28)，半自动占7.5%（3/40）。其它原因各2次。

2.3 全自动法与半自动法检测HBV-M常规样本中复检样本数据分析

2.3.1 样本一般情况2011年6月至2013年4月半自动法共检测HBV-M44984例，复检1596例；2013年6月至2015年4月全自动法共检测48694例，复检873例。根据初检HBV-M模式将需复检标本分四组，将模式“15”“145”中HBsAg S/CO值1～3为A组；“15”“145”中HBsAg S/CO值3～5为B组；“15”“145”中HBsAg S/CO值5～10为C组；“1”“12”“1245”“23”“2345”“124”“125”“1235”“14”这些少见模式为D组。具体分布情况如表2所示。

2.3.2 两检测系统复检样本的符合率比较从表2看出全自动法检测HBV-M总的复检率(1.62%)明显低于半自动法(3.55%），二者差异有显著性（P＜0.01）。且两检测系统在每组复检标本的符合率上均有显著性差异（P＜0.05），特别是在少见模式组和HBsAg弱阳性样本A和B组的差异更显著（P＜0.01）。具体见表3。

3 讨论

ELISA是实验室最为常用的免疫测定技术之一，广泛用于临床疾病血液及其它体液标志物的检测。通常是以微孔板条为固相的测定模式，以抗原抗体免疫反应为基础的测定方法，一般涉及标本的前处理、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色以及结果的判断和解释等方面。其中任一步骤的不规范都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚[4，5]。目前各级临床实验室在进行ELISA测定时自动化水平不一，在ELISA标准化方面做的不足，这导致检测结果的假阴性与假阳性数量增多，影响检测结果[6]。本文通过回顾性分析比较本实验室引进全自动高通量后和先前半自动ELISA检测系统对HBV-M检测结果的差异，探讨全自动ELISA检测系统在常规HBV-M样本检测中的应用价值。

表1 全自动法与半自动法室内质控失控率的比较（%）

表2 两检测系统复检样本分布率（%）

表3 两检测系统复检样本的符合率比较（%）

本研究从近两年的室内质控数据分析显示，全自动法检测HBV-M，每项目弱阳性质控品的批间CV值和失控率均小于半自动法；从失控原因分类上看，全自动法因人为因素造成的失控（28.6%）明显少于半自动法（60%）。在人为因素中，全自动法检测主要是实验前的准备不足造成（试剂准备、洗液配制、质控品的使用等情况），半自动法检测除了上述因素还增加了温育温度和时间的控制、洗板的方式等主要原因。这表明全自动法严格控制加样、温育、洗板、结果判读等过程，同项测定的每一次实验条件几乎一致，确保了操作的稳定性，避免了人为误差，提高了检测的重复性和稳定性。同时我们应该看到，两检测系统因仪器因素造成失控比例不少，特别是全自动占了50%，这表明仪器的正确使用、定期的维护和校准，是进一步保证检测结果准确稳定的重要因素。

由于HBV的固有流行病学特征，使其血清学标志物检出模式复杂化，再者ELISA法检测HBVM影响因素较多，常出现假阳性或假阴性结果，已有相关HBV-M少见模式分析的研究报道[7，8]。本文对近四年常规检测HBV-M临床样本的复检情况进行分析，结果表明，应用全自动法后对少见模式样本的复检率明显降低（P＜0.01），且复检正确率明显高于半自动法（P＜0.01）。另一方面，有作者认为，对临床标本HBsAg的检测结果，首次定性阴性的基本可以认为是真阴性，而阳性反应者不一定为真阳性[9]。HBsAg的定性结果对于乙肝的诊断和治疗非常重要[10]，因此临床检测HBsAg为弱阳性时，要复检以确保结果的准确性。本文进一步将复检标本“145”(小三阳)和“15”阳性的标本按HBsAg的S/CO值分三组（1～3、3～5、5～10），每组在应用全自动检测系统后的复检率均明显降低（P＜0.01），且复检符合率均明显高于半自动法（P＜0.05），特别是HBsAg弱阳性样本（S/CO值1～5）的复检符合率显著高于半自动法（P＜0.01）。这表明应用全自动检测系统大大提高了检测的准确性，同时降低了实验成本。

综上所述，本实验室ELISA检测HBV-M近四年数据的回顾性分析结果，提示全自动高通量ELISA检测系统的稳定性、重复性以及准确性均优于半自动法，有利于HBV-M ELISA检测的标准化，提高该项目的检测质量，值得在临床实验室推广应用。

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Clinical application comparison of full-automatic and semi-automatic ELISA methods for detecting HBV serologic markers

SHEN Jing，XU Rumei，FAN Xuejiao，et al.
Department of Clinical Laboratory，Fujian Provincial Hospital，Provincial Clinical College of Fujian Medical University，Fuzhou 350001，China.

Objective To investigate the clinical value of automatic ELISA system in detecting HBV serologic markers-HB-sAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，and HBcAb(HBV M)，to determine the deference between full-automatic ELISA methods(automatic method)and semi-automatic ELISA methods(semi-automatic method).Methods A retrospective study was made.The data of HBV M test using semi-automatic method from June 2011 to April 2013 and automatic method from June 2013 to April 2015 were collected.CV of S/CO of internal quality control with a weak positive value，rate of out-of-control，cause of out-of-control，retest rate and accuracy of retest samples in routine laboratory work were calculated for statistical analysis.Results Of the automatic method，the CVs in internal quality control of HBV M（24.66%，25.44%，23.8%，49.64%and 70.14%）were lower than that of semi-automatic method（27.67%，34.32%，29.21%，54.88%and 90.6%）respectively，and the rate of out-of-control（0.99%，1. 66%，1.32%，0.66%and 0.5%）were also lower than that of semi-automatic method（1.5%，1.82%，1.66%，1.0%and 0.67%）respectively，but without statistically significance(P＞0.05).Similarly the retest rate from automatic method for routine samples（1. 62%）were lower than that in semi-automatic method significantly（3.55%）（P＜0.01)，and the accuracy of retest samples（55.37%）in ordinary laboratory work was higher than that in semi-automatic method（42.11%）（P＜0.01），especially in rare pattern of HBV M and samples with weakly positive HBsAg.Conclusion The stability，repeatability and accuracy of the automatic ELISA method were superior to that of semi-automatic method in detection of serum HBV markers.

ELISA；automation method；semi-automation method；HBV

R446.61，R512.6+2

A

1674-1129(2015)06-0701-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2015.06.003

2015-09-09；

2015-10-16)

卫生部医药卫生科技发展研究中心，课题编号：28-1-2作者简介：沈菁，女，1973年5月生，副主任技师，主要从事临床免疫工作

伍严安，女，1954年5月生，主任医师，硕士生导师，主要从事免疫分子诊断的相关性研究